馮 輝，潘艷艷，李 瑩，曹雅明

瘧疾是人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲(chóng)感染性疾病。2010年世界瘧疾報(bào)告顯示，2009年有2～3億瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)［1］。我國(guó)也制定了“十二·五”期間在中國(guó)境內(nèi)消滅瘧疾的宏偉計(jì)劃。因此，研制開(kāi)發(fā)瘧疾疫苗和抗瘧新藥已經(jīng)成為當(dāng)今世界亟待解決的重大課題，而瘧原蟲(chóng)感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)基礎(chǔ)研究是其重要前提［2］。

動(dòng)物模型和人體研究的結(jié)果均已表明：固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與抗瘧保護(hù)性免疫應(yīng)答。固有免疫應(yīng)答有直接抗瘧原蟲(chóng)效應(yīng)，在清除瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞（iRBCs）中抗瘧天然免疫發(fā)揮重要防御作用［3－5］。CD4＋T細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)感染過(guò)程中，通過(guò)分泌以IFN－γ增加為主的Th1型細(xì)胞因子顯著遏制原蟲(chóng)的爆發(fā)性增殖［6－7］。固有免疫對(duì)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答尤其是CD4＋T細(xì)胞和抗體應(yīng)答是必需的［8］。然而，固有免疫應(yīng)答過(guò)強(qiáng)亦可導(dǎo)致重癥瘧疾等相關(guān)病理?yè)p傷［9］。目前，與適應(yīng)性免疫應(yīng)答機(jī)制研究相比，固有免疫在瘧疾急性期感染中的保護(hù)性作用尚有待深入研究與闡明。

巨噬細(xì)胞是參與固有免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。體內(nèi)注射氯磷酸二鈉脂質(zhì)體是一種有效消除體內(nèi)巨噬細(xì)胞的方法［10－11］。為此，本研究擬通過(guò)建立巨噬細(xì)胞消除的鼠瘧模型，探討吞噬細(xì)胞在致死型約氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodiumyoelii17XL，P．yoelii17XL）感染的BALB／c小鼠模型中的作用地位及可能的免疫保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲(chóng)與主要試劑 6～8w齡，雌性BALB／c小鼠，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。P．yoelii17XL，日本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng)。以下單克隆抗體（mAb）均購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience：抗－F4／80－FITC mAb（BM8）和FcγIII／II封閉抗體（2．4G2）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染和吞噬細(xì)胞消除模型建立 在感染－2、0d腹腔注射氯磷酸二鈉脂質(zhì)體（clodronate liposomes，300μL／只／次），建立巨噬細(xì)胞體內(nèi)消除模型。對(duì)照組小鼠在同時(shí)點(diǎn)注射同體積PBS脂質(zhì)體。小鼠腹腔注射1×106P．yoelii17XL寄生的紅細(xì)胞（pRBC）。尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計(jì)數(shù)原蟲(chóng)血癥，動(dòng)態(tài)觀察生存率。

1．3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠感染0d、3d和5d常規(guī)無(wú)菌摘取脾臟，用10mL含5%熱滅活FCS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，350×g室溫離心10 min。經(jīng)0．17mol／L NH4Cl裂解紅細(xì)胞、RPMI1640洗滌2次，以臺(tái)盼藍(lán)液檢查脾細(xì)胞活性，確定活細(xì)胞超過(guò)90%。用含10%FCS的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107個(gè)／mL，24孔培養(yǎng)板（FALCON），每孔加入500μL細(xì)胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)48h。350×g室溫離心10min，收集上清，－80℃保存，待細(xì)胞因子測(cè)定。

1．4 脾細(xì)胞FACs分析 取0．1mL脾細(xì)胞懸液，預(yù)先加入FcγⅢ／Ⅱ封閉抗體1μg封閉30min。設(shè)陰性對(duì)照管，每份樣品同時(shí)用抗－F4／80－FITC進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記，4℃孵育30min。洗滌1次，棄上清，用0．5ml FBS／PBS重懸細(xì)胞，待流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．5 細(xì)胞獲取與分析 利用流式細(xì)胞儀（FACSAria II，美國(guó)B＆D公司）獲取細(xì)胞，使用前向散射角（FSC）及側(cè)向散射角（SSC）確定淋巴細(xì)胞群。以陰性對(duì)照為參考，每個(gè)樣品獲取10 000～50 000個(gè)細(xì)胞。利用FAC expressV3software分析流式結(jié)果。

1．6 細(xì)胞因子檢測(cè) 雙抗體夾心ELISA法分別對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN－γ、IL－10含量進(jìn)行定量檢測(cè)，酶標(biāo)儀（InterMedNJ－2100）測(cè)定450nm 處 OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量（pg／mL）。

1．7 NO水平檢測(cè) Griess方法檢測(cè)NO－2濃度，酶標(biāo)儀（InterMedNJ－2100）測(cè)定550nm 處 OD 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO含量（μmol／L）。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student’sttest比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P≤0．05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2．1P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組原蟲(chóng)血癥和生存率 PBS脂質(zhì)體對(duì)照在感染后2d外周血出現(xiàn)感染紅細(xì)胞，原蟲(chóng)血癥于感染后6d達(dá)峰值42．5%。小鼠感染后5d出現(xiàn)死亡，達(dá)峰值后小鼠全部死亡。巨噬細(xì)胞消除組原蟲(chóng)血癥較對(duì)照組比較提前出現(xiàn)，于感染后4d達(dá)峰值40．8%。巨噬細(xì)胞消除組在感染后1d出現(xiàn)死亡，于原蟲(chóng)血癥達(dá)峰值后，即感染后5d小鼠全部死亡。由此顯示，巨噬細(xì)胞消除后加速P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠的感染進(jìn)程且明顯影響瘧疾感染的最終結(jié)局。

2．2P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組脾巨噬細(xì)胞數(shù)量 為評(píng)估巨噬細(xì)胞消除效果，F(xiàn)ACS檢測(cè)兩組小鼠脾巨噬細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在感染后0d，巨噬細(xì)胞消除組脾F4／80＋巨噬細(xì)胞占脾總細(xì)胞數(shù)的百分率和細(xì)胞絕對(duì)值均明顯降低（P＜0．01）。在感染后3～5 d，巨噬細(xì)胞消除組脾F4／80＋巨噬細(xì)胞百分率和細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量一直保持低水平，明顯低于對(duì)照組（P＜0．01）。由此表明，巨噬細(xì)胞消除模型建立成功。

圖1 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組原蟲(chóng)血癥（A）和生存率（B）Fig．1 P．yoelii 17XL infection in BALB／c mice from macrophage depleted group and control groupA：Parasitemia；B：Survival rate of mice．

2．3P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組脾炎癥因子水平 我們對(duì)參與調(diào)控瘧疾感染的重要前炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在感染后3～5d，巨噬細(xì)胞消除組小鼠脾上清IFN－γ分泌水平明顯降低（P＜0．01），IL－10分泌水平亦明顯降低（P＜0．01）。在感染后3～5d，巨噬細(xì)胞代表性因子NO在巨噬細(xì)胞

消除組明顯降低（P＜0．01）。

圖2 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組脾巨噬細(xì)胞數(shù)量比較A：巨噬細(xì)胞占脾細(xì)胞總數(shù)的百分含量；B：巨噬細(xì)胞絕對(duì)值。＊＊：P＜0．01．Fig．2 Comparison on the number of macrophages in BALB／c infected with P．yoelii 17XL from macrophage depleted group and control groupA：Percentage of macrophages in spleen cells；B：Absolute numbers of macrophages；＊＊：P＜0．01．

圖3 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細(xì)胞消除和對(duì)照組脾臟炎癥因子水平A：IFN－γ水平；B：IL－10水平；C：NO水平；＊＊：P＜0．01．Fig．3 The levels of pro－inflammation in BALB／c infected with P．yoelii 17XL from macrophage depleted group and control groupA：IFN－γ；B：IL－10；C：NO；＊＊：P＜0．01．

3 討 論

固有免疫應(yīng)答參與控制瘧疾感染。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與瘧疾感染結(jié)局密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞消除后，以IFN－γ為代表的前炎癥應(yīng)答水平明顯降低，巨噬細(xì)胞特征性因子NO水平明顯降低，抗炎癥細(xì)胞因子IL－10亦明顯降低，原蟲(chóng)血癥峰值提前出現(xiàn)。由此顯示，巨噬細(xì)胞消除加速瘧疾感染進(jìn)程且加重疾病嚴(yán)重性，進(jìn)而證實(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)控制紅內(nèi)期感染發(fā)揮重要免疫保護(hù)作用。

血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞對(duì)控制原蟲(chóng)血癥發(fā)揮重要作用，清除iRBCs與單核－巨噬細(xì)胞功能活性有關(guān)［12］。研究證實(shí)，惡性瘧患者外周血循環(huán)中的單核細(xì)胞在體外具有很強(qiáng)的抗體依賴細(xì)胞抑制活性（ADCI）。瘧原蟲(chóng)感染可以誘導(dǎo)單核－巨噬細(xì)胞以抗體非依賴方式直接削弱原蟲(chóng)負(fù)荷，同時(shí)通過(guò)啟動(dòng)和調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答，以抗體依賴的調(diào)理作用和ADCI方式清除iRBCs［13］。本研究利用巨噬細(xì)胞消除模型進(jìn)而感染致死型約氏瘧原蟲(chóng)，結(jié)果顯示，感染后1d小鼠即出現(xiàn)死亡，且原蟲(chóng)血癥增殖速度和幅度明顯高于對(duì)照組，由此進(jìn)一步證實(shí)在瘧原蟲(chóng)感染早期巨噬細(xì)胞具有重要的控制原蟲(chóng)血癥作用。

最新研究證實(shí)，分別感染P．yoelii17XL或P．yoelii17XNL的BALB／c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞裂解pRBC能力增強(qiáng)，這與巨噬細(xì)胞表面TLR2和胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 MyD88，IRAK－1和TRAF－6表達(dá)增高有關(guān)［14］。與無(wú)法抵抗P．yoelii17XL感染相比，BALB／c小鼠更能控制P．yoelii17XNL感染與巨噬細(xì)胞TLR高表達(dá)維持更長(zhǎng)時(shí)間有關(guān)［14］。我們近期研究證實(shí)，牛膝多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑可上調(diào)巨噬細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答，進(jìn)而抵抗P．yoelii17XL感染［15］。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞消除組Th1型細(xì)胞因子IFN－γ分泌水平明顯受到影響，不能有效建立CD4＋Th1型免疫應(yīng)答。由此進(jìn)一步強(qiáng)化固有免疫應(yīng)答對(duì)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要性。

綜上，固有免疫在抗瘧免疫防御中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。固有免疫重要的執(zhí)行細(xì)胞—巨噬細(xì)胞在抗紅內(nèi)期瘧疾感染中的作用不容忽視。本研究通過(guò)鼠瘧模型證實(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)控制紅內(nèi)期感染具有重要作用。如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性，進(jìn)而有效地干預(yù)和控制紅內(nèi)期感染，有待我們進(jìn)一步深入探討。

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