白 蘭 王迪迪 王春敏 姚海濤 盧北燕 朱貴明 佟秀鳳 張 燕 佟麗波

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000)

子宮內(nèi)膜癌因確切病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，疾病的浸潤和轉(zhuǎn)移一直都是困擾治療的難題。所以從多種途徑早期發(fā)現(xiàn)和針對(duì)其早期浸潤轉(zhuǎn)移入手進(jìn)行有針對(duì)性的治療是治療成敗的關(guān)鍵。近年來有關(guān)人角化層糜蛋白酶(KLK7)、E-鈣黏蛋白(E-Cad)在某些腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起到的作用已引起人們注意〔1～3〕，但在子宮內(nèi)膜癌中研究較少。本研究檢測(cè)KLK7蛋白、E-Cad在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，探討兩者表達(dá)狀況與病情進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2010年8月至2011年5月在佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行初次手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜樣腺癌30例;增生期子宮內(nèi)膜10例、子宮內(nèi)膜不典型增生10例，均來自因不規(guī)則陰道流血行刮宮術(shù)的標(biāo)本。所有病人術(shù)前均未接受放、化療及激素治療，年齡30～80歲，平均55歲，其病程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。切除組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)診斷。子宮內(nèi)膜癌按照FIGO(2009)標(biāo)準(zhǔn)分期，組織學(xué)分級(jí)參照WHO標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)切除標(biāo)本離體后立即自子宮內(nèi)膜原發(fā)病灶分離出腫瘤組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)至－80℃冰箱保存?zhèn)溆茫溆嗖糠炙筒±頇z查。

1.2 儀器及試劑 兔抗人KLK7多克隆抗體及兔抗人E-Cad多克隆抗體(北京博奧森公司)，儀器由佳木斯大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法 取子宮內(nèi)膜癌組織及其他各組組織各50 μg/孔，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，用干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉膜1 h后，分別加入1∶1 000兔抗人KLK7抗體，1∶500兔抗人E-Cad抗體，室溫?fù)u床1 h，4℃孵育過夜;加入二抗，室溫?fù)u床1 h，ECL顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。各組間計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)應(yīng)用條件的采用Fisher精確概率計(jì)算法。計(jì)量資料兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用snk-q檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡結(jié)果 KLK7蛋白在28 kD、E-Cad在97 kD處可見特異性抗體結(jié)合蛋白表達(dá)條帶。參照β-actin表達(dá)條帶吸光度值，在蛋白上樣量一致的前提下，將KLK7、E-Cad與βactin光密度比值作為其相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜組織中KLK7、E-Cad的Western印跡檢測(cè)結(jié)果

2.2 KLK7和E-Cad相對(duì)表達(dá)量 增生期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜樣腺癌KLK7的相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.18、0.94±0.23、1.11±0.17;E-Cad的相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.15、0.94±0.10、0.52±0.06。表明 KLK7蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均顯著高于增生期子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜不典型增生。E-Cad在子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均顯著低于增生期子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜不典型增生。

2.3 KLK7蛋白、E-Cad在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)與不同臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 KLK7蛋白和E-Cad在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平與年齡無相關(guān)性;KLK7蛋白的陽性表達(dá)率和表達(dá)水平在臨床晚期、低分化組、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者及深肌層浸潤者子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中明顯高于臨床早期、高分化組、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移及無或淺肌層浸潤者。而E-Cad與KLK7蛋白的表達(dá)正好相反。見表1。

2.4 子宮內(nèi)膜樣腺癌中KLK7和E-Cad表達(dá)的相關(guān)性 在30例子宮內(nèi)膜樣腺癌中，KLK7與E-Cad共同陽性9例，共同陰性1例，KLK7陽性、E-Cad陰性14例，E-Cad陽性、KLK7陰性6例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，KLK7蛋白與E-Cad在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.394，P＜0.05)。

表1 不同臨床病理指標(biāo)的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中KLK7蛋白及E-Cad的表達(dá)情況(±s)

表1 不同臨床病理指標(biāo)的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中KLK7蛋白及E-Cad的表達(dá)情況(±s)

與I期相比：1)P＜0.05;與G1相比：2)P＜0.05;與無或淺肌層浸潤相比：3)P＜0.05;與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比：4)P＜0.01

病理特征 n KLK7蛋白陽性〔n(%)〕表達(dá)水平E-Cad陽性〔n(%)〕表達(dá)水平年齡＞50歲 13 10(77) 1.18±0.08 12(92) 0.51±0.17≤50歲 17 14(82) 1.17±0.14 10(59) 0.41±0.10手術(shù)分期Ⅰ期 19 16(84) 1.07±0.081) 15(79) 0.75±0.17Ⅱ期 6 4(67) 1.23±0.05 4(67) 0.51±0.161)Ⅲ ～Ⅳ期 5 4(67) 1.36±0.101) 3(60) 0.46±0.121)病理分級(jí)G1 19 14(74) 1.12±0.07 16(84) 0.73±0.17 G2～G3 11 10(91) 1.31±0.042) 8(73) 0.44±0.102)肌層浸潤無或淺肌層 24 19(79) 1.03±0.10 18(75) 0.75±0.18深肌層 6 5(83) 1.33±0.103) 4(67) 0.40±0.123)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 12 11(92) 1.32±0.034) 5(42) 0.36±0.174)無 18 13(72) 1.13±0.07 17(94)0.68±0.17

3 討論

KLK7是人組織激肽釋放酶家族的一個(gè)新成員，是一種分泌型絲氨酸蛋白酶。最初的研究發(fā)現(xiàn)，KLK7僅存在于角質(zhì)層中，并由角質(zhì)層上皮細(xì)胞特異性表達(dá)，參與皮膚脫屑〔1〕。目前研究發(fā)現(xiàn)角化層蛋白酶之間可能存在級(jí)聯(lián)反應(yīng)，已證實(shí)KLK5可以激活KLK7的前體成為有活性的蛋白酶，最適 pH5～7，KLK7可以直接降解角化細(xì)胞間的黏連蛋白，如角化粒蛋白和橋粒糖蛋白〔2〕。絲氨酸蛋白酶作為蛋白降解酶家族的一個(gè)成員介導(dǎo)相鄰細(xì)胞外基質(zhì)的消化，促使腫瘤細(xì)胞的生長，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫落到周圍環(huán)境中。本研究結(jié)果提示KLK7可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的一個(gè)高危因素，與Prezas等〔2〕、何霞等〔3〕結(jié)果基本一致。結(jié)合KLK7在皮膚中的作用是促進(jìn)角質(zhì)層細(xì)胞脫落機(jī)制，進(jìn)一步推測(cè)子宮內(nèi)膜癌中KLK7在促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的作用極可能與絲氨酸蛋白酶參與細(xì)胞間質(zhì)的溶解和腫瘤進(jìn)展中早期瘤細(xì)胞脫落有關(guān)。

E-Cad屬鈣黏素家族成員，是一種表達(dá)于不同組織的依賴Ca2+的同種親和性細(xì)胞間黏附分子，為細(xì)胞間黏附分子家族的主要成員，廣泛位于上皮細(xì)胞間黏附連接處，在建立和維持細(xì)胞群體、信號(hào)傳導(dǎo)及組織結(jié)構(gòu)完整性等方面起著關(guān)鍵作用。ECad是一種跨膜糖蛋白，分為細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)，細(xì)胞外區(qū)為信號(hào)肽結(jié)構(gòu);跨膜區(qū)起著膜固定作用，是細(xì)胞外區(qū)黏附功能所必不可少的;細(xì)胞質(zhì)區(qū)與信息傳遞和細(xì)胞穩(wěn)定有關(guān)〔4，5〕。腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白含量下降導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖和易轉(zhuǎn)移機(jī)制已被大家所接受。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，當(dāng)E-Cad在在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達(dá)下降時(shí)，細(xì)胞間的相互黏附力下降，造成細(xì)胞容易分散而向外周浸潤性生長;而在生長過程中轉(zhuǎn)移的必要條件一旦滿足，腫瘤細(xì)胞就更易脫離原發(fā)灶而發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)一步進(jìn)展和惡化。提示E-Cad在子宮內(nèi)膜樣腺癌組中表達(dá)下降低可能是子宮內(nèi)膜深肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素。

Johnson等〔6〕研究表明，在胰腺癌組織中hk7與E-Cad之間存在密切關(guān)系，即在胰腺癌中hK7通過降減細(xì)胞外基質(zhì)中的E-鈣黏蛋白增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果提示KLK7蛋白與E-Cad表達(dá)可能存在某種調(diào)控關(guān)系，它們協(xié)同參與了子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移過程。兩者之間是否有此協(xié)同作用及有關(guān)在子宮內(nèi)膜樣腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中是否存在KLK7降減E-Cad這一相互作用機(jī)制本實(shí)驗(yàn)尚未涉及，還需應(yīng)用分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，筆者認(rèn)為在子宮內(nèi)膜樣腺癌中聯(lián)合檢測(cè)KLK7及E-Cad的表達(dá)有望成為監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜樣腺癌患者病情進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。但本實(shí)驗(yàn)的樣本量還不足夠多，還需進(jìn)一步收集病例和實(shí)驗(yàn)。

1 Yamasaki K，Schauber J，Coda A，et al.Kallikrein-mediated proteolysis regulates the antimicrobial effects of cathelicidins in skin〔J〕.FASEB J，2006;20(12)：2068.

2 Prezas P，Arlt MJ，Viktorov P，et al.Over expression of the human tissue kallikrein genes KLK4，5，6and 7 increases the malignant phenotype of ovarian cancer cells〔J〕.Biol Chem，2006;387(6)：807-8.

3 何 霞，羅 梅，薛家強(qiáng).KLK7蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕. 重慶醫(yī)學(xué)，2009;38(16)：2032-5.

4 Imamura Y，Itoh M，Maeno Y，et al.Functional domains of alpha-catenin required for the strong state of cadherin based cell adhesion〔J〕.Cell Biol，1999;144(6)：1311-22.

5 Heimann R，Lan F，Mebride R，et al.Separating favorable from unfavorable prognostic markers in breast cancer：the role of E-Cadherin〔J〕.Cancer Res，2000;60(2)：298-304.

6 Johnson SK，Ramani VC，Hennings L，et al.Kallikrein 7 enhances pancreatic cancer cell invasion by shedding Ecadherin〔J〕.Cancer，2007;109(9)：1811.