謝銀珠，沈微，王正祥

(江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

酸性普魯蘭酶基因在地衣芽孢桿菌中的表達*

謝銀珠，沈微，王正祥

(江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

根據(jù)Genbank公布的來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶基因突變體序列(AX203843)合成普魯蘭酶成熟肽基因。將該基因插入芽孢桿菌分泌型表達載體pHY-WZX，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌B60608，重組地衣芽孢桿菌實現(xiàn)普魯蘭酶分泌表達。對重組菌產(chǎn)普魯蘭酶的條件進行優(yōu)化，以含2%藥媒和8%甘油的培養(yǎng)基最適合普魯蘭酶表達。

普魯蘭酶，地衣芽孢桿菌，Bacillus deramificans

普魯蘭酶是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α-l，6-糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)支，形成直鏈淀粉的脫支酶［1］。普魯蘭酶能將最小單位的支鏈分解，在淀粉制糖工業(yè)中與糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉。目前普魯蘭酶是淀粉制糖酶系中唯一一種我國尚不能自主生產(chǎn)的產(chǎn)品。國內(nèi)外有關(guān)普魯蘭酶及其基因已有大量的文獻報道，在這些信息中最具有應(yīng)用價值的應(yīng)該是來源于芽孢桿菌及其近緣種屬的普魯蘭酶基因的信息，因為芽孢桿菌具有向細胞外大量分泌蛋白質(zhì)的能力，同時芽孢桿菌的外源基因表達技術(shù)也比較成熟。為充分利用國外研究成果，本研究組根據(jù)已公布的來源于芽孢桿菌近緣種屬的普魯蘭酶基因序列采用化學合成的方法合成了多條普魯蘭酶基因，并利用地衣芽孢桿菌為宿主進行異源表達，本文報道Bacillus deramificans一突變體基因的表達情況。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

采用的普魯蘭酶基因為Bacillus deramificans普魯蘭酶基因突變體，其序列由NCBI數(shù)據(jù)庫查尋獲得，其登錄號AX203843。普魯蘭酶基因由上海生物工程有限公司合成，合成后基因插入載體pUC18獲得重組質(zhì)粒 pUC-pulA?？莶菅挎邨U菌桿菌(B.subtilis)WB600和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)B60608均由江南大學工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點實驗室保藏。芽孢桿菌表達載體pHY-WZX由江南大學工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點實驗室構(gòu)建，該質(zhì)粒以地衣芽孢桿菌淀粉酶生產(chǎn)菌控制淀粉酶表達的強啟動子和信號肽控制外源基因的表達。

1.2 工具酶與試劑

PyrobestTMDNA聚合酶、T4DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶購于(大連)寶生物公司;PCR產(chǎn)物(小量)純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購于上海華舜生物工程有限公司;引物由上海生物工程有限公司合成。Red-Pullulan多糖為愛爾蘭Megazyme公司產(chǎn)品。標準普魯蘭酶酶液(1100 ASPU/mL)購于杰能科公司。其他試劑藥品為進口或國產(chǎn)分析純和生化試劑。

1.3 DNA操作技術(shù)

質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接等參照文獻［2］。DNA擴增在0.2 L PCR薄壁管中進行。PCR擴增條件為:94℃ 50 s，56℃ 90s，72℃ 3 min，循環(huán)30次。

1.4 普魯蘭酶基因表達載體的構(gòu)建

根據(jù)普魯蘭酶基因序列，設(shè)計如下引物 Pyz01:5'-AATTACCGGAATTCGATGGGAACACGACAACGATC-3'和Pyz02:5'-AATTACCGGGTACCTTACTTTTTACCGTGGTCTGG-3'，以pUC-pulA為模板用 PCR方法擴增出普魯蘭酶成熟肽編碼基因pulA。所得片段用Kpn I和 EcoR I酶切后，插入經(jīng)Kpn I和 EcoR I雙酶切的載體 pHY-WZX［3］，得到重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA。

1.5 重組菌的構(gòu)建

將1.4得到的重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌 WB600［4］，篩選得到重組子 WB600(pHY-WZX-pulA)。從重組子 WB600(pHY-WZX-pulA)中提取重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌 B60608［5］。

1.6 普魯蘭酶酶活測定

普魯蘭酶酶活單位定義:在相應(yīng)條件下，每分鐘分解普魯蘭所釋放的還原糖，其還原力相當于1 μmol葡萄糖所需的酶量，以1ASPU表示。普魯蘭酶酶活的測定參考Megazyme公司Red-Pullulan使用說明書并以杰能科公司市售普魯蘭酶(1100ASPU/mL)作為標準對照，驗證測定方法。

1.7 發(fā)酵試驗

種子培養(yǎng)基:(LB液體培養(yǎng)基):1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸提物、1%NaCl。添加1.5%瓊脂粉為LB固體培養(yǎng)基。添加10 μg/mL四環(huán)素分別用于重組枯草芽孢桿菌或重組地衣芽孢桿菌的篩選。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:4%碳源，1.5%棉籽粉，0.3%硫酸銨，0.03%CaCl2，11 mmol/L 磷酸鹽。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基:8%甘油 ，2%藥媒(棉籽蛋白粉)，0.3%(NH4)2SO4，0.03%CaCl2，11 mmol/L磷酸鹽。

2 結(jié)果與討論

2.1 Bacillus deramificans普魯蘭酶基因的克隆和重組表達載體的構(gòu)建

以Bacillus deramificans DNA為模板，Pyz 01和Pyz 02為引物，在PyrobestTMDNA聚合酶的作用下，PCR擴增普魯蘭酶成熟肽結(jié)構(gòu)基因。擴增出的片段大小為2.8kb。將PCR產(chǎn)物純化后用Kpn I和 EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pHY-WZX載體連接，直接連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，在含四環(huán)素的LB平板上得到3個轉(zhuǎn)化子。其中1號轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒經(jīng) Kpn I和 EcoR I酶切電泳，產(chǎn)生2.8kb和6.7kb大小的片段(圖1)，分別與普魯蘭酶基因和空載線性pHY-WZX大小一致，符合質(zhì)粒 pHY-WZX-pulA的基本特征(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA酶切驗證

2.2 普魯蘭酶基因的異源表達

圖2 重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA

從1.5中獲得的重組枯草芽孢桿菌WB600(pHY-WZX-pulA)中大量提取重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA，用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌B60608。重組菌B60608接種含10 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，42℃振蕩培養(yǎng)15h后，取5 mL菌液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間，測定酶活。結(jié)果表明，含重組質(zhì)粒pHY-WZX-pulA的重組地衣芽孢桿菌成功表達出有普魯蘭降解活性的普魯蘭酶，普魯蘭酶成功分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液酶活為0.12 ASPU/mL(發(fā)酵液)而含空質(zhì)粒pHY-WZX的重組地衣芽孢桿菌培養(yǎng)液不具有普魯蘭降解活性。

2.3 發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1 最適碳源

分別以乳糖、甘油、可溶性淀粉、糯米淀粉、馬鈴薯淀粉、木糖、葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源，在同一條件下進行發(fā)酵，檢測重組菌B60608產(chǎn)酶情況，結(jié)果見圖3。

圖3 不同碳源對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

圖3 表明，不同碳源對重組菌B60608產(chǎn)酶影響較大，甘油為產(chǎn)酶最佳碳源。以甘油為碳源，采用不同的加量，保持其他條件不變進行搖瓶發(fā)酵實驗，結(jié)果見圖4。由圖4可知，培養(yǎng)基中最適的甘油含量為8%。

2.3.2 最適有機氮源

選取幾種不同的有機氮源作為培養(yǎng)基中的唯一有機氮源，在同一條件下進行發(fā)酵，測定不同有機氮源對重組菌B60608發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，產(chǎn)酶結(jié)果見圖5。由圖5可知，以藥媒作為氮源時所獲酶活最高。以藥媒為唯一氮源，考察不同藥媒加量對產(chǎn)酶影響，結(jié)果見圖6。從圖6中可以得出，2%藥媒為發(fā)酵培養(yǎng)基中最適有機氮源。

圖4 甘油添加量對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

圖5 不同有機氮源對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

圖6 藥煤含量對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

2.3.3 最適無機氮源

選取不同的無機氮源，在同一條件下進行發(fā)酵，考察其對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，(NH4)2SO4對產(chǎn)酶具有促進效果，選取(NH4)2SO4為無機氮源。以(NH4)2SO4作為無機氮源，考察不同加量的(NH4)2SO4對產(chǎn)酶影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，0.3%(NH4)2SO4為發(fā)酵培養(yǎng)基最適無機氮加量。

圖7 不同無機氮源對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

圖8 (NH4)2SO4濃度對產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響

3 討論

本研究組根據(jù)國外專利合成了多條來源于芽孢桿菌及其近緣種屬的普魯蘭酶基因，并以大腸桿菌和地衣芽孢桿菌為宿主進行異源表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因中只有少數(shù)能表達出明顯的普魯蘭降解活性(另文發(fā)表)，其中諾維信公司和杰能科公司公布的來源于Bacillus deramificans和Bacillus acidopullulyticus的普魯蘭酶基因的表達產(chǎn)物具有較高的普魯蘭降解活性。本文報道的是研究來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶基因的一個突變體在地衣芽孢桿菌中的表達情況，該基因編碼產(chǎn)物為928個氨基酸殘基的成熟肽蛋白，分子量約10萬，經(jīng)條件優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵水平為1.5 ASPU/mL，酶活存在于培養(yǎng)液中。據(jù)了解美國杰能科公司等也是采用重組地衣芽孢桿菌生產(chǎn)普魯蘭酶，而普魯蘭酶基因也是Bacillus deramificans來源的突變體，其發(fā)酵產(chǎn)酶水平估計在1000 ASPU/mL以上。蛋白電泳顯示，含重組質(zhì)粒 pHY-WZX-pulA的重組地衣芽孢桿菌與含pHY-WZX空質(zhì)粒的地衣芽孢桿菌的蛋白譜在10萬左右未見明顯差異，這說明重組菌普魯蘭酶蛋白表達量還很低，提高蛋白表達量是提高普魯蘭酶表達水平的關(guān)鍵技術(shù)。

4 結(jié)論

本研究利用芽孢桿菌分泌型表達載體pHY-WZX研究了來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶的一個突變體基因pulA的表達方法。在地衣芽孢桿菌淀粉酶基因的啟動子和信號肽控制下pulA成功實現(xiàn)分泌表達，表達產(chǎn)物具有Red-Pullulan多糖降解活性并且全部分泌到培養(yǎng)液中。對重組菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)化的培養(yǎng)基組成;碳源為8%甘油，氮源為2%藥媒及0.3%的硫酸銨。

［1］ Nair SU，Singhal RS，Kamat MY.Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13［J］.Bioresource Technology，2007，98(4):856－859.

［2］ 諸葛健，王正祥.工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1994.

［3］ Niu D，Wang ZX.Development of a pair of bifunctional expression vectors for Escherichia coli and Bacillus licheniformis［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2007，34(5):357－362.

［4］ Imanaka T，Tanaka T，Tsunekawa H，et al.Cloning of the genes for penicillinase，penP and penI，of Bacillus licheniformis in some vector plasmids and their expression in Escherichia coli，Bacillus subtilis，and Bacillus licheniformis［J］.Journal of Bacteriology，1981，147(3):776 －786.

［5］ 莫靜燕，陳獻忠，王正祥.地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化研究［J］.生物技術(shù)，2009，19(5):75－77.

Expression of the Acid Pullulanase in Bacillus licheniformis

Xie Yin-zhu，Shen Wei，Wang Zheng-xiang
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education and School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

According to the sequence of pullulanase gene from Bacillus deramificans(NCBI accession number:AX203843)，the gene encoding mature peptide of pulluanase was synthesized and designated pulA.The pulA was amplified by the method of PCR and cloned into the expression vector pHY－WZX，yielding hybrid plasmid pHYWZX－pulA.Subsequently，pHY－WZX－pulA was introduced into Bacillus licheniformis B60608.Active pullulanase was expressed by recombiant B.licheniformis and secreted into medium.Culture condition of recombinant B.licheniformis were optimized for production of pullulanase.The optimized medium consists of 2%cotton seed protein and 8%of glycerol.

pullulanase，Bacillus licheniformis，Bacillus deramificans

碩士研究生(王正祥教授為通訊作者，E-mail:zxwang@jiangnan.edu.cn)。

*國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2006AA10Z307)

2010－08－01，改回日期:2010－11－30