魏濤，何培新，封盛雪，魏東芝

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州，450002)

懷牛膝多糖的超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性活性*

魏濤，何培新，封盛雪，魏東芝

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州，450002)

研 究懷牛膝多糖的超聲波提取工藝和抗氧化性。在單因素實驗基礎(chǔ)上采用正交實驗得出超聲波提取懷牛膝多糖的適宜工藝條件，即超聲波功率1 000 W、提取溫度60℃、提取時間60 min、料液比(g∶mL)1∶30。在此提取工藝條件下，粗多糖得率為6.1%。體外抗氧化性實驗表明，所提取懷牛膝多糖具有較好的抗氧化性，對H2O2、O2－·和·OH的清除率分別可達(dá)到75.1%、90.3%和61.3%。

懷 牛膝，多糖，超聲波提取，抗氧化性

牛膝(Achyranthes bidentata Blume)為莧科多年生草本植物，其干燥根具有藥用價值，可用來治療肝陽眩暈，產(chǎn)后腹痛，跌打損傷等病癥［1］。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS)是牛膝的主要藥效成分之一，具有延緩衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和抗腫瘤、降血糖、治哮喘等多種功效［2］，具有廣闊的藥物開發(fā)及應(yīng)用前景。牛膝主要分為懷牛膝和川牛膝2種，前者主產(chǎn)河南省，后者主產(chǎn)于四川省、貴州省、云南省、福建等地。本文的研究對象為懷牛膝。

本研究在傳統(tǒng)水提法的基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助處理，在單因素實驗基礎(chǔ)上采用正交實驗得出提取牛膝多糖的適宜工藝，并對提取的多糖進(jìn)行抗氧化性的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半干牛膝片(河南懷牛膝)，購自河南省焦作市武陟縣。

核黃素(南京桂輝化工);L-蛋氨酸(張家港市華昌藥業(yè)有限公司);硫代巴比妥酸(上海銳聰科技發(fā)展有限公司);98%H2SO4，無水乙醇，正丁醇，苯酚，三氯甲烷等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海左科儀器設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)，JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，SHB-3循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)，索氏提取儀(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)，紫外可見光分光光度計(上海分析儀器總廠)，臺式離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)等。

1.3 提取方法

1.3.1 懷牛膝多糖提取工藝流程［3］

懷牛膝→70℃干燥→粉碎過40目篩→石油醚脫脂，體積分?jǐn)?shù)80%乙醇回流→超聲波輔助水浸提→離心取上清液→Sevage法除蛋白→濃縮→乙醇沉淀→過濾洗滌→低溫干燥→懷牛膝粗多糖

1.3.2 操作要點(diǎn)

稱取6 g懷牛膝粉置于索氏提取器中，加入石油乙醚(60～90℃)200 mL，90℃ 回流脫脂5 h;脫脂之后加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，90℃回流2次(每次2 h)，除去單糖、多酚、低聚糖和皂苷等小分子物質(zhì);乙醇揮發(fā)后，按照不同的超聲功率、浸提時間、浸提溫度和料液比進(jìn)行懷牛膝多糖提取。將提取的懷牛膝多糖，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇析出多糖，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后再加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇醇析，反復(fù)3次，將沉淀用無水乙醇洗滌，真空干燥，得懷牛膝水溶性多糖。采用Sevage法去除提取懷牛膝多糖中的蛋白質(zhì)，少量蒸餾水溶解懷牛膝多糖，按粗多糖溶液與三氯甲烷-正丁醇(體積比4∶1)混合液以體積比5∶1混合，充分振蕩30 min靜止分層，4 200 r/min離心15 min，將中間液面白色物質(zhì)和下層的有機(jī)溶劑除去。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液真空濃縮至原液的1/4～1/5左右。向濃縮液加入4倍體積的無水乙醇，在4℃的冰箱內(nèi)放置12 h，然后5 000 r/min離心15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌2次，干燥后即得懷牛膝粗多糖。

1.3.3 懷牛膝多糖得率和含量的測定方法

多糖得率的計算方法:粗多糖得率(%)=粗多糖的質(zhì)量(g)/懷牛膝粉的質(zhì)量(g);多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.4 不同單因素對懷牛膝多糖提取效果的影響

1.4.1 超聲功率

在提取時間40 min，料液溫度50℃，料液比(g∶mL)1∶20的條件下，分別采用表1中各功率，提取懷牛膝多糖。

1.4.2 料液溫度

在超聲功率600 W，提取時間40 min，料液比1∶20的條件下，分別采用表1中溫度，提取懷牛膝多糖。

1.4.3 提取時間

在超聲功率600 W，提取溫度50℃，料液比(g∶mL)1∶20的條件下，分別采用表1中提取時間，提取懷牛膝多糖。

1.4.4 料液比

在超聲功率600 W，提取時間40 min，提取溫度50℃，分別采用表1中料液比，提取懷牛膝多糖。

表1 懷牛膝多糖提取工藝中各因素水平

1.5 懷牛膝多糖提取工藝條件的優(yōu)化

以懷牛膝多糖得率為考察指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)用正交實驗法，優(yōu)化懷牛膝多糖最佳提取工藝。

1.6 多糖抗氧化性活性的測定

1.6.1 懷牛膝多糖對·OH的清除作用

采用辣根過氧化酶法［4］:取一定濃度的懷牛膝多糖溶液0.1 mL，加入0.1 mL H2O2(10 mmol/L)在室溫放置30 min，再加入0.1 mL辣根過氧化物酶(0.3 mol/mL)，反應(yīng)10 min后在波長610 nm測定吸光度，對照組以蒸餾水代替多糖，計算清除率。

1.6.2 懷牛膝多糖對·OH的清除作用

利用 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，采用 2-脫氧-D-核糖法測定懷牛膝多糖對·OH的清除作用［5］:試管中依次加入0.6 mL KH2PO4-KOH緩沖液(50 mmol/L，pH值7.4)，0.15 mL一定濃度的多糖溶液，0.15 mL EDTA 溶液(1 mmol/L)，0.15 mL FeCl3(1 mmol/L)，0.15 mL H2O2(12 mmol/L)，0.15 mL 2-脫氧-D-核糖(60 mmol/L)和0.15 mL抗壞血酸(2 mmol/L)。然后將試管置于37℃水浴鍋中水浴1 h，取出后迅速加入1.5 mL 25%HCl和1.5 mL 1%硫代巴比妥酸(TBA)，在沸水中加熱20 min后取出，冷卻，于532 nm處測定吸光度值，對照組以蒸餾水代替待測樣品。按照下式計算清除率:

1.6.3 懷牛膝多糖對O2－·自由基的清除作用

采用核黃素-光照法［6］:用磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH值7.8)分別配制0.1 mmol/L NBT溶液，0.1 mmol/L核黃素溶液，0.1 mol/L L-蛋氨酸溶液。在試管中依次加入0.075 mL提取懷牛膝多糖樣品，0.3 mL NBT，0.15 mL L-蛋氨酸，0.15 mL 核黃素和4.4 mL磷酸鹽緩沖液，混勻，對照組以蒸餾水代替待測樣品。在暗箱光照30 min之后在560 nm處測定吸光度值。按照下式計算清除率:

2 結(jié)果與分析

2.1 懷牛膝多糖提取單因素試驗結(jié)果

采用超聲波輔助水提法，以懷牛膝多糖得率為指標(biāo)，分別進(jìn)行影響懷牛膝得率的主要單因素試驗，結(jié)果如圖1所示。多糖得率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)升高趨勢，至800 W時多糖得率達(dá)到5.31%，以后趨于平緩。提取溫度對多糖得率影響顯著，到70℃達(dá)到最大6.0%，高溫有助于懷牛膝細(xì)胞壁膨脹破裂，加速多糖溶解。提取時間在20、40、60 min的多糖得率分別為3.4%、4.4%、5.6%，到80 min時，多糖得率不再增加，表明多糖已基本提取完全。隨著料液比增加，多糖得率提高，但隨著加水量增大，多糖得率有所下降。

圖1 單因素不同條件下的懷牛膝多糖含量

2.2 懷牛膝多糖超聲波提取最佳工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以超聲功率，提取溫度，提取時間和料液比做4因素3水平L9(34)的正交試驗設(shè)計，對懷牛膝多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，實驗結(jié)果和極差分析見表2和3。

表2 超聲波輔助提取懷牛膝多糖工藝參數(shù)優(yōu)化L9(34)正交試驗篩選結(jié)果

表3 超聲波輔助提取懷牛膝多糖最佳工藝正交試驗結(jié)果方差分析

從極差結(jié)果得出，影響多糖提取率的因素大小為RA＞RB＞RC＞RD，即提取溫度＞提取時間＞超聲功率＞料液比。方差分析結(jié)果表明，提取溫度對懷牛膝多糖提取率影響顯著;超聲功率、提取時間和料液比對懷牛膝多糖提取率影響不顯著。因此，最佳提取條件為A2B3C3D3，即超聲功率1 000 W，提取溫度為60℃，提取時間為60 min，料液比為1∶30。在此條件提取懷牛膝多糖提取率為6.1%。

2.3 懷牛膝多糖對H2O2的清除作用

H2O2是氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)，極易形成自由基，在反應(yīng)體系中對H2O2的清除率越高，表明對活性氧的清除作用越強(qiáng)，實驗結(jié)果如圖2所示。懷牛膝多糖對H2O2具有一定的清除作用，隨著多糖濃度增加其清除率逐漸上升，當(dāng)多糖濃度為6 mg/mL時，清除率與Vc大致相同;當(dāng)多糖濃度達(dá)到12 mg/mL時，對H2O2的清除率達(dá)到最大值75.1%，清除率明顯高于VC(58.1%)，說明懷牛膝多糖的抗氧化能力優(yōu)于VC。

圖2 懷牛膝多糖對H2O2清除效應(yīng)

2.4 懷牛膝多糖對O2－·的清除作用

O2－·是所有氧自由基中的第一個自由基，可以經(jīng)一系列反應(yīng)生成其他氧自由基，與許多疾病密切相關(guān)，因此測定懷牛膝多糖對超氧陰離子自由基的清除作用具有重要的意義。由圖3可知，懷牛膝多糖對·具有清除能力，并且清除率隨著濃度的增大而增大。當(dāng)濃度達(dá)到12 mg/mL時，懷牛膝多糖對·清除率為90.3%，高于Vc的清除率82.1%，說明懷牛膝多糖對·的抗氧化能力優(yōu)于。

圖3 懷牛膝多糖對超氧陰離子自由基清除效應(yīng)

2.5 懷牛膝多糖對·OH的清除作用

圖4 懷牛膝多糖對羥基自由基清除效應(yīng)

羥自由基的化學(xué)性質(zhì)極為活潑，也是毒性最大的自由基，可以與多種有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng)。懷牛膝多糖對·OH作用效果見圖4。隨著多糖濃度增加，·OH的清除率逐步提高，當(dāng)多糖濃度為12 mg/mL時，·OH的清除率達(dá)到61.3%，低于Vc對·OH的清除率75%，說明懷牛膝多糖對·OH的抗氧化能力低于Vc。

3 結(jié)論

本研究在超聲波功率、提取溫度、提取時間和料液比各單因素實驗基礎(chǔ)上，采用正交實驗得出了超聲波輔助提取懷牛膝多糖的最佳工藝條件，即超聲波功率1 000 W，提取溫度60℃，超聲時間60 min，料液比(g∶mL)1∶30。采用該工藝提取懷牛膝多糖，懷牛膝多糖得率為6.1%。本實驗結(jié)果表明懷牛膝多糖具有較好的抗氧化活性，對H2O2、O2－·和·OH的清除率可分別達(dá)到75.1%、90.3%和61.3%。從懷牛膝多糖對H2O2、O2－·和·OH的清除率可知，懷牛膝多糖對各種形式的活性氧均有清除作用，并且清除率與多糖濃度有關(guān)。其原因可能是多糖分子上具有還原性的半醛酸羥基，可與活性氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)［7］。

［1］ 中華人民共和國藥典委員會編.中華人民共和國藥典［M］.北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［2］ 黃芳，蒙義文.活性多糖的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)雜志，1999(2):90－98.

［3］ 李金忠，馬海樂，吳沿友，等.超聲波提取山藥多糖的研究［J］.糧油食品科技，2005，13(5):14－15.

［4］ 舒媛，劉安軍，王麗霞.山藥多糖結(jié)合蛋白對抗氧化作用的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(11);39－42.

［5］ 焦中高，劉杰超，王思新，等.黑莓紅色素對活性氧自由基和亞硝基的清除作用［J］.食品工業(yè)科技，2004，25(4):127－128.

［6］ 廣東淮山水溶性多糖的分離純化及體外抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2003，24(11)129－133.

［7］ 李玲，陳常秀.大棗多糖的分離及抗氧化性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(9):49 －51.

Study on the Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Polysaccharides from Achyranthes bidentata Blume and Its Anti-oxidant Activities

Wei Tao，He Pei-xin，F(xiàn)eng Sheng-xue，Wei Dong-zhi
(School of Food and Biological Engineering Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The ultrasonic-assisted extraction technology of crude polysaccharide from Achyranthes bidentata Blume and its antioxidant activities of the polysaccharide were investigated.On the basis of single factor test，extraction technology condition was optimized by orthogonal test.Our results showed the best extracting condition was as follows:ultrasonic power 1 000W，extracting temperature 60℃，extracting time 60 min，and material-water ratio 1∶30.Under the above conditions，the extraction rate of the crude polysaccharide can reach to 6.1%.Meanwhile，the scavenging activity of the polysaccharide on H2O2，O－2· and ·OH free radicals were both significant.The clearance rates was up to 75.1%，90.3%and 61.3%respectively.

Achyranthes bidentata Blume，polysaccharide，ultrasonic extraction，antioxidative activity

博士，講師。

*河南省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項目(102102210063);鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金(000544)

2010－09－13，改回日期:2010－12－03