陳荀，張曉利，劉書亮

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

動物性食品源空腸彎曲桿菌二重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用*

陳荀，張曉利，劉書亮

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

根 據(jù)GenBank空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni，Cj)的16S rDNA及hip O(編碼馬尿酸酶基因)序列設(shè)計兩對特異引物，建立檢測動物性食品源Cj的二重PCR方法，并應(yīng)用于樣品檢測。結(jié)果顯示只對Cj能特異的擴增出699bp和366bp兩個基因片段，而大腸桿菌、沙門氏菌等其他11種細菌均未擴增出條帶;Cj標(biāo)準株ATCC33560的16S rDNA及hip O序列與GenBank其他Cj的相應(yīng)序列具高度相似性(分別為99.7% ～99.9%，98.1% ～99.7%);該方法可在27h內(nèi)完成，其靈敏度為2.4～16 CFU/mL;四川省雅安市雞肉、豬肉、牛肉和牛奶樣品中的Cj陽性率分別為38.0%(19/50)、28.3%(15/53)、17.1%(6/35)和8.6%(4/46)。

二 重PCR，空腸彎曲桿菌，動物性食品，檢測

空腸彎曲桿菌是重要的腸道致病菌，通過食用受到污染的動物產(chǎn)品如未經(jīng)煮熟的禽肉或生牛奶或生熟交叉污染的熟食品可引起腸道腹瀉。而兒童、老人以及免疫壓抑病人被感染后若不及時治療，還會發(fā)展成更嚴重的疾病，如格林-巴利綜合征(Guillain-Barré)、急性神經(jīng)肌肉癱瘓及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等。在發(fā)達國家，空腸彎曲菌在腹瀉病人中分離率已超過5%，年感染發(fā)病率超過50人/100，000人，分離率超過了沙門氏菌和志賀氏菌［1］。在中國，空腸彎曲桿菌也是主要的腹瀉病原菌之一［2］。

由于空腸彎曲桿菌具有一種“活而不可培養(yǎng)”(VBNC)狀態(tài)且培養(yǎng)條件苛刻，分離食品中的空腸彎曲桿菌較困難，常規(guī)生化方法鑒定比較繁瑣，費時費力;而PCR方法以其靈敏度高、特異性強、檢測快捷等優(yōu)點而倍受青睞。因此，建立空腸彎曲桿菌快速、靈敏而又特異的檢測方法，是有效控制和預(yù)防該類食源性疾病的關(guān)鍵所在。本研究針對空腸彎曲桿菌的16S rDNA和hip O基因(編碼馬尿酸酶基因)設(shè)計兩對特異引物，成功建立了一種快速、靈敏、特異的食源空腸彎曲桿菌的二重PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從四川雅安市各超市和農(nóng)貿(mào)市場抽取雞肉50份、豬肉53份、牛肉35份，某奶牛場抽取鮮牛奶46份。

1.1.2 實驗菌種

空腸彎曲桿菌(Campylobcrterjejuni，Cj)ATCC33560、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29215、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)GIM1.228、藤 黃 微 球 菌 (Micrococcusluteus)ATCC10209、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)CICC21482、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)P8、糞鏈球菌(Streptococcus fecal)S1、熱死環(huán)絲菌(Brochothrix thermosphacta)T5、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)M2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B1，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室保存。

1.1.3 主要藥品試劑

2×long Taq PCR MasterMix、Gold View 核酸染料、DNA Maker DL2000購于北京天根生化有限公司;DNA膠回收試劑盒，pMD18-T Vector、Ligation Mix購于寶生物工程有限公司。其余試劑為分析純或生化試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基及抗生素

LB肉湯、布氏肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限公司;頭孢哌酮購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司。

1.1.5 主要儀器

MyCyclerPCR 儀(Bio-RAD)，PowerPac Basic電泳儀及水平電泳槽(Bio-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)，Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)(Millipore公司)，B4i-BR4i冷凍離心機(Thermo)等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與增菌培養(yǎng)

按微生物采樣要求，將采集的肉類樣品放于保鮮袋中，牛奶樣品置于無菌離心管中，每個樣品重約50g(mL)，3～5℃左右保存，2h內(nèi)送到實驗室。

將新鮮肉樣剪碎混勻，取約5 g放入50 mL帶螺旋口的無菌離心管中，加入布氏肉湯至離心管口1.5～2.0 cm左右，擰緊管蓋，先在37℃下培養(yǎng)4h，再加入100 μL頭孢哌酮(30 mg/L)，擰緊管蓋顛倒混勻［3］，再于42℃下培養(yǎng)20 h。生牛奶樣品先調(diào)節(jié)至pH7.6左右，4℃，10 000 r/min冷凍離心30 min后去上清液，加入布氏肉湯至接近管口1.5～2.0 cm左右，溶解沉淀，后續(xù)處理同肉樣。

1.2.2 動物性食品源Cj的二重PCR方法建立

1.2.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的空腸彎曲桿菌16S rDNA及hip O基因序列利用primer5設(shè)計兩對特異性引物(表1)，由invitrogen公司合成。

表1 靶基因名稱、引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.2.2 DNA模板提取

根據(jù) Isabel等方法［4］提取增菌液中細菌總DNA。

1.2.2.3 PCR擴增

經(jīng)過多次預(yù)實驗確定PCR反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板 1.5 μL，引物各 1 μL，雙蒸水 7 μL。循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性 4 min，94℃30 s，61.5℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)后 72℃延伸 6 min。將 PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后，觀察并成像。

1.2.2.4 特異性

提取Cj標(biāo)準菌株ATCC33560與大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等11種細菌DNA，進行二重PCR方法的特異性考察。

1.2.2.5 擴增產(chǎn)物測序鑒定

對Cj標(biāo)準菌株ATCC33560的16S rDNA、hip O基因擴增片段進行膠回收、再進行T克隆后由invitrogen公司測序，并進行序列分析。

1.2.2.6 敏感性試驗

取Cj標(biāo)準菌株ATCC33560過夜培養(yǎng)的布氏肉湯菌液以 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8倍稀釋，然后每個稀釋菌液各取1 mL分別進行平板活菌計數(shù)和提取細菌總DNA，每個濃度平行3次。平板置于42℃微需氧條件下培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，用ISO［5］標(biāo)準方法計算菌落總數(shù)。公式為:

式中:ξc，所有的菌落數(shù)在15～300之間的平板總菌落數(shù)之和;n1，第1個稀釋度的平板個數(shù);n2，第2個稀釋度的平板個數(shù);d，與第1個稀釋度相關(guān)的稀釋倍數(shù)(如 10－2)。

所提DNA用作PCR檢測的模板。實驗重復(fù)3次。

1.2.2.7 人工布菌

⑴樣品處理。將采集到的雞肉、豬肉、牛肉絞碎后，平鋪于保鮮袋中，盡量使其與空氣相接觸(因為Cj為微需氧菌，在空氣中暴露時間過久會死亡)，4℃存放1W。牛奶經(jīng)115℃滅菌15 min。處理后樣品中經(jīng)二重PCR檢測為陰性即可做人工布菌實驗。

⑵接種。按含Cj約800 CFU/g或800 CFU/mL對處理后的雞肉、豬肉、牛肉和牛奶接種 Cj ATCC33560，按1.2.1對樣品進行增菌培養(yǎng)24 h。

⑶二重PCR方法檢測。取增菌液1 mL提取細菌DNA，進行二重PCR檢測，每種樣品重復(fù)3次。

1.2.3 二重PCR方法檢測食源性Cj的應(yīng)用

對四川省雅安市采集的動物性食品樣品按照

1.2.1 所述方法増菌后進行二重PCR檢測，評價污染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重PCR方法的特異性

電泳結(jié)果(圖1)表明，該兩對引物僅能對空腸彎曲桿菌擴增出兩個特異片段，大小分別約為700 bp和350 bp，與設(shè)計DNA片段大小相符。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、糞鏈球菌、熱死環(huán)絲菌、沙門氏菌、植物乳桿菌、奇異變形桿菌和枯草芽孢桿菌11種細菌均未有擴增產(chǎn)物。表明該方法具有很好的特異性。

圖1 不同細菌16S rDNA、hip O基因PCR電泳結(jié)果

2.2 空腸彎曲桿菌16S rDNA、hip O基因序列分析

以ATCC33560的DNA為模板，擴增的16S rDNA、hip O基因單一基因產(chǎn)物序列分析表明，該菌株16S rDNA、hip O基因 PCR產(chǎn)物測序分別得到長699bp和366bp的片斷，與設(shè)計大小相符;測得序列已在 NCBI注冊，登錄號分別為 GQ249178和GQ249180。采用BLAST和DNASTAR MegAlign進行基因比對分析:

ATCC33560的16S rDNA(GQ249178)與空腸彎曲菌登錄號AM933373.1、AM933374.1等的16S rDNA基因序列有99.7% ～99.9%的同源性，ATCC33560的hip O基因(GQ249180)與空腸彎曲菌登錄號FJ655194.1、FJ655193.1等的馬尿酸鈉酶相應(yīng)基因序列有98.1%～99.7%的同源性。進一步表明該方法正確和特異。

2.3 二重PCR方法的敏感性

敏感性實驗的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖2)表明，當(dāng)菌液稀釋至10－7倍時還能擴增出特異性片段，10－8倍稀釋菌液則不能擴增特異性片段。根據(jù)公式(1)得到3次重復(fù)的原菌液濃度分別為2.4×107、1.6×108、8.2×107CFU/mL，因此該二重 PCR 方法檢測的敏感度為2.4～16 CFU/mL。

2.4 人工布菌結(jié)果

用建立的二重PCR方法對人工布菌的食品樣品進行檢測，對經(jīng)過處理后無空腸彎曲菌的雞肉、豬肉、牛肉、生牛奶各一份進行人工布菌，經(jīng)過24 h的增菌培養(yǎng)后都能擴增出約700bp和350bp的特異性片段(圖3)，表明該二重PCR方法檢測食品源空腸彎曲桿菌是可行的。

圖2 二重PCR方法檢測空腸彎曲桿菌敏感性的電泳結(jié)果

圖3 二重PCR方法檢測人工布菌的電泳結(jié)果

2.5 二重PCR方法檢測動物性食品中空腸彎曲桿菌污染的調(diào)查結(jié)果

采用二重PCR方法檢測動物性食品中空腸彎曲桿菌，通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)少數(shù)樣品僅能擴增出16S rDNA片段，但并沒有擴增出hip O基因片段，推測可能是彎曲菌屬的其他種類;同時也有少量的樣品僅能檢測出hip O基因片段，如圖4所示，推測可能是其他具有馬尿酸鈉酶基因的未知菌。本實驗結(jié)果只統(tǒng)計能擴增出兩個片段的樣品為陽性。二重PCR方法檢測雞肉、豬肉、牛肉和牛奶中空腸彎曲菌的陽性率分別為 38.0%(19/50)、28.3%(15/53)、17.1%(6/35)及8.6%(4/46)。

3 討論與結(jié)果

3.1 檢測動物性食品空腸彎曲菌二重PCR方法的建立

由于空腸彎曲桿菌在食品樣品中的存在量很低，培養(yǎng)條件苛刻且易進入VBNC狀態(tài)，常規(guī)生化檢測周期較長(通常為1～2 w)，且存在快速馬尿酸鹽水解試驗假陰性和假陽性的菌株［6］，導(dǎo)致空腸彎曲桿菌的生化檢測非常困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法尤其是多重PCR方法以其靈敏度高、特異性強、檢測快捷等優(yōu)點而越來越多地應(yīng)用到病原菌的快速檢測中。

本實驗根據(jù)空腸彎曲桿菌16S rDNA和hip O基因序列設(shè)計兩對引物，用于食品中空腸彎曲桿菌的檢測。結(jié)果表明該二重PCR方法對空腸彎曲桿菌具有特異性，而對大腸桿菌、沙門氏菌等11種細菌均不能擴增出特異性片段。對空腸彎曲桿菌標(biāo)準菌株ATCC33560擴增得到的16S rDNA及hip O基因的PCR產(chǎn)物克隆序列分析結(jié)果進一步表明該二重PCR方法具有很好的特異性。本實驗建立的二重PCR方法檢測限為2.4～16CFU/mL，檢測周期27h，與傳統(tǒng)空腸彎曲桿菌檢測方法相比特異性更強，靈敏度高且檢測周期短。袁寶君［6］等建立多重PCR方法檢測限度為15CFU/mL，檢測周期為 40h;何蕊［7］等建立的多重PCR方法檢測限為6CFU/10 mL，但檢測周期為2d;侯建軍等［8］建立的 PCR方法檢測靈敏度為6CFU/mL，檢測周期為48h。以上數(shù)據(jù)表明本方法靈敏度較高、檢測周期較短，適于食源空腸彎曲桿菌的快速檢測。

另外，本實驗通過二重PCR檢測發(fā)現(xiàn)少數(shù)樣品僅能擴增出16S rDNA或hip O基因的特異性片段，表明用單一的16S rDNA或hip O引物不能完全用作空腸彎曲桿菌的檢測，這與文獻報道一致［9］。本研究首次采用16S rDNA及hip O基因的二重PCR方法檢測食源空腸彎曲桿菌，提高了方法的特異性。

3.2 二重PCR方法檢測食源性空腸彎曲菌的應(yīng)用及其污染情況

研究表明，零售肉類尤其是雞肉產(chǎn)品中空腸彎曲桿菌污染較為普遍［10－14］。調(diào)查結(jié)果顯示，四川省雅安市市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染率高達38.0%，豬肉、牛肉、牛奶的污染率分別為28.3%、17.1%和 8.6%，與國內(nèi)的相關(guān)報道一致［8，13］。這可能與農(nóng)貿(mào)市場和街邊市場零售、超市肉類中空腸彎曲桿菌的污染程度有關(guān)。由于雅安地區(qū)雞肉、豬肉、牛肉、牛奶中空腸彎曲桿菌污染率比較高，將對消費者健康構(gòu)成威脅。因此，有必要采取降低危害的針對性措施，包括規(guī)范飼養(yǎng)，減少運輸污染，改善肉類屠宰加工衛(wèi)生條件，提高消費者的食品安全意識，實施“從養(yǎng)殖場到餐桌”的全程質(zhì)量管理體系，運用多重PCR檢測方法長期監(jiān)測動物性食品源空腸彎曲菌的發(fā)生及變化規(guī)律，可以有效控制和預(yù)防食源性空腸彎曲菌病發(fā)生，從而保證食品安全與人類健康。

圖4 二重PCR檢測部分雞肉、牛肉樣品中空腸彎曲桿菌電泳結(jié)果

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Development and Application of Multiplex PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Animal Origin Food

Chen Xun，Zhong Xiao-li，Liu Shu-liang
(Cdlege of Food，Sichun Agricultural University，Ya’an 625014，China)

According to the 16S rDNA and hip O gene sequences of C.jejuni in GenBank，two pairs of specific primers were designed and used in multiplex PCR for detection of C.jejuni in animal origin food.Multiplex PCR was developed and applied to the sample testing.The results indicated that two specific fragments(699bp and 366bp)were detected after amplification of the DNA template of C.jejuni，while other bacteria strains(11 species tested)were not detected.Meanwhile，the 16S rDNA and hip O gene sequence of C.jejuni ATCC33560 exhibited a high similarity with those of some strains of C.jejuni presented in GenBank.The total assay could be completed in 27h with a detection limit of 2.4 ～16CFU/mL.The chicken，pork，beef and milk from Ya＇an markets in Sichuan province were detected by the multiplex PCR，and 38.0%，28.3%，17.1%and 8.6%of them were found respectively to be positive for C.jejuni.Multiplex PCR assay was specific，sensitive and time－ saving，which provided reference for detection of C.jejuni in animal origin food.

multiplex PCR，Campylobacter jejuni，animal origin food，detection

碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者，E-mail:lsliang999@163.com)。

*“十一·五國家科技支撐計劃”課題(2006BAK02A03-4)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項子課題(200903055)

2010－07－21，改回日期:2010－11－11