喬德亮，陳乃富，張莉，陳科

1(皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽六安，237012)2(安徽仿生傳感與檢測技術(shù)省級實(shí)驗(yàn)室，安徽六安，237012)

雙孢蘑菇子實(shí)體多糖提取條件優(yōu)化及部分特性研究*

喬德亮1，2，陳乃富1，2，張莉1，2，陳科1，2

1(皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽六安，237012)2(安徽仿生傳感與檢測技術(shù)省級實(shí)驗(yàn)室，安徽六安，237012)

運(yùn) 用熱水浸提、乙醇沉淀、Sevag法脫蛋白、乙醇再沉淀的方法提取雙孢蘑菇子實(shí)體多糖。在單因素(提取溫度、提取時間、水料比及提取次數(shù))實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，對多糖的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化得到的提取條件為:溫度80℃、時間4 h、水料比50 mL/g、提取3次，該條件下多糖的提取率為3.5105%。苯酚-硫酸法測量粗多糖產(chǎn)品的多糖含量為71.84%。在10 mg/mL、25℃條件下，烏氏黏度計法測量粗多糖產(chǎn)品的相對黏度(相對于去離子水)為1.109 6。KBr壓片法掃描了粗多糖的紅外光譜，多糖的特征吸收峰(3 700～3 100 cm－1和3 000～2 800 cm－1)清晰可見。

雙 孢蘑菇，多糖，提取，正交實(shí)驗(yàn)，特性

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)，中文別名為蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇、雙孢菇等，在歐美各國常被稱之為普通栽培蘑菇(common cultivated mushroom)或紐扣蘑菇(button mushroom)?，F(xiàn)代研究顯示，雙孢蘑菇富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素、核苷酸和不飽和脂肪酸等，它不僅營養(yǎng)豐富、味道鮮美，還具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用和保健功能［1－7］。

關(guān)于雙孢蘑菇多糖，已有一些報道，如菌絲體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)［8］，子實(shí)體多糖的單糖組成［9］、抑制癌細(xì)胞作用［10］、抗菌作用［11］、抗氧化作用［12］，菌柄多糖的提取工藝優(yōu)化［13］，但其子實(shí)體多糖的提取參數(shù)優(yōu)化及一些理化性質(zhì)未見報道。本課題在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)法對雙孢蘑菇子實(shí)體多糖的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，同時也報道了該多糖的部分特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器設(shè)備與試劑

雙孢蘑菇子實(shí)體購自安徽省守紅農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，新鮮子實(shí)體切成小塊狀，60℃烘干、粉碎備用。

數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型)，常州國華電器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(101AS-2型)，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度計(SP-752型)，上海光譜儀器有限公司;烏氏黏度計，南京大展機(jī)電技術(shù)研究所;紅外光譜儀(WQF-310型)，北京第二光學(xué)儀器廠。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，其他試劑均為常規(guī)分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取

多糖的提取參照許泓瑜等［14］、張民等［15］報道的方法稍作修改。取干燥粉碎的材料加去離子水進(jìn)行熱水浸提(提取溫度60～100℃，提取時間2～5 h，水料比10～50 mL/g，提取1～4次)。將浸提液離心(5 000 r/min，15 min)，取上清液，沉淀物用相同方法重新提取，重提液再離心(5 000 r/min，15 min)取上清液。合并上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50℃減壓濃縮至適量，濃縮液加3倍體積無水乙醇(乙醇終濃度為75%)沉淀過夜，離心(5 000 r/min，15 min)取沉淀物，得到水溶性粗提物。

粗提物采用Sevag法脫除游離蛋白。粗提物加適量水溶解，再加入1/5溶液體積的三氯甲烷-正丁醇(體積比5∶1)混合液，搖床劇烈振蕩20～30 min，分液漏斗靜置(20～30 min)使其分層，去除下層有機(jī)溶劑-蛋白相。上清液用相同方法反復(fù)脫蛋白若干次，直至分液漏斗內(nèi)兩液面間無蛋白層為止。最后將上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50℃減壓濃縮至適量。濃縮液加9倍體積無水乙醇(乙醇終濃度為90%)沉淀過夜，離心(5 000 r/min，15 min)取沉淀物，沉淀物置60℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.2.2 多糖含量、相對黏度測定

多糖含量的測定參照 Dubois等［16］、張惟杰［17］報道的苯酚-硫酸比色法稍作修改，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對黏度的測定使用烏氏黏度計按照說明書進(jìn)行，以去離子水作對照。測量條件為樣品濃度10 mg/mL、溫度25℃。

1.2.3 紅外光譜分析

紅外光譜分析參照孫元琳等［18］、Maciel等［19］報道的溴化鉀壓片法。使用傅立葉變換紅外光譜儀，掃描范圍為4 400 cm ～400 cm－1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)時因素水平的確定均以多糖提取率為判斷指標(biāo)。多糖提取率的計算:

多糖提取率/%=［粗多糖中多糖質(zhì)量(g)/原材料質(zhì)量(g)］×100

粗多糖中多糖質(zhì)量/g=粗多糖質(zhì)量(g)×粗多糖中多糖含量百分比(%)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

提取溫度設(shè)置60、70、80、90和100℃5個梯度，提取時間、水料比及提取次數(shù)分別為4 h、40 mL/g和3次，此時提取溫度對雙孢蘑菇多糖提取率的影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)提取溫度在60～100℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高多糖提取率逐漸增加，至90℃后再提高溫度，多糖提取率開始逐漸下降，不過90℃與100℃的提取率差異不顯著(P＞0.05)。有研究報道，溫度升高可增加多糖的擴(kuò)散系數(shù)和溶解性，有利于多糖從材料介質(zhì)中進(jìn)入提取溶劑內(nèi)，從而可提高多糖的提取率。但溫度過高，可能引起多糖鏈的水解，提取率反而下降［20－21］。本研究結(jié)果與其類似。

圖1 提取溫度對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

統(tǒng)計分析表明，60、70、80和90℃四者之間多糖提取率差異顯著(P＜ 0.05)，60、70、80和100℃四者之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)，但90℃和100℃之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)。這些結(jié)果顯示:當(dāng)溫度小于90℃時，提取溫度對雙孢蘑菇多糖提取率的影響呈正向顯著性;當(dāng)溫度大于90℃時，提取溫度對雙孢蘑菇多糖提取率的影響不顯著。所以為了節(jié)約能源和提取成本，90℃被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)提取溫度的中心點(diǎn)。

2.2 提取時間對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

提取時間設(shè)置2、3、4和5 h 4個梯度，提取溫度、水料比及提取次數(shù)分別是90℃、40 mL/g和3次，此時提取時間對雙孢蘑菇多糖提取率的影響見圖2。從圖2可以看出，提取時間在2～5 h范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，多糖提取率呈逐漸增加趨勢。研究顯示，提取時間是另一個影響提取率的主要因素，提取時間與多糖提取率呈正相關(guān)，即時間的延長可提高多糖的得率［14］。本研究結(jié)果與其基本一致。

圖2 提取時間對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

統(tǒng)計分析表明，2、3和4 h三者之間多糖提取率差異顯著(P＜0.05)，2、3和5 h三者之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)，但4 h和5 h之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)。這些結(jié)果顯示:提取低于4 h時，提取時間對雙孢蘑菇多糖提取率的影響呈正向顯著性;超過4 h時，提取時間對雙孢蘑菇多糖提取率的影響不顯著。所以4 h被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)提取時間的中心點(diǎn)。

2.3 水料比對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

水料比設(shè)置10、20、30、40和50 mL/g五個梯度，提取溫度、時間及提取次數(shù)分別是90℃、4 h和3次，此時水料比對雙孢蘑菇多糖提取率的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)水料比由10 mL/g增加到50 mL/g時，雙孢蘑菇多糖的提取率呈逐漸增加趨勢。張民等［15］報道水體積的增加有利于多糖物質(zhì)的運(yùn)輸，從而可以提高多糖的提取率，但超過一定比例后影響并不顯著。本研究結(jié)果與此類似。

統(tǒng)計分析表明，10、20、30和40 mL/g四者之間多糖提取率差異顯著(P＜ 0.05)，10、20、30和 50 mL/g四者之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)，但40 mL/g和50 mL/g兩者之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)。這些結(jié)果顯示:當(dāng)水料比小于40 mL/g時，水料比對雙孢蘑菇多糖提取率的影響呈正向顯著性;當(dāng)水料比大于40 mL/g時，水料比對雙孢蘑菇多糖提取率的影響不顯著。考慮加水過多不利于后期的濃縮，所以40 mL/g被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)水料比的中心點(diǎn)。

2.4 提取次數(shù)對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

提取次數(shù)設(shè)置1、2、3和4次四個梯度，提取溫度、時間及水料比分別是90℃、4 h和40 mL/g，此時提取次數(shù)對雙孢蘑菇多糖提取率的影響如圖4所示。從圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，雙孢蘑菇多糖的提取率也逐漸增多，呈上升趨勢。統(tǒng)計分析表明，1次、2次與3次三者之間多糖提取率差異顯著(P＜0.05)，1次、2次與4次三者之間多糖提取率差異也顯著(P＜0.05)，但3次與4次之間多糖提取率差異不顯著(P＞0.05)。綜合考慮產(chǎn)量和提取成本，3次被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)提取次數(shù)的中心點(diǎn)。

圖3 水料比對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對雙孢蘑菇多糖提取率的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化雙孢菇多糖的提取條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，以多糖提取得率為指標(biāo)，對雙孢蘑菇多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果列于表1。

表1 雙孢蘑菇多糖提取條件優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

由表1中R的大小可知，提取次數(shù)對雙孢蘑菇多糖的提取率影響最大，其次分別為提取時間、提取溫度和水料比，即各因素的影響大小順序?yàn)锳 ＞C＞D＞B。從表中均值大小可以看出，提取條件的最優(yōu)組合為A2B3C2D1，而由表中實(shí)驗(yàn)值大小得出的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，兩者結(jié)果不一致，因此需做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

取3份雙孢蘑菇樣品，以最優(yōu)條件組合(A2B3C2D1)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果多糖的提取率為3.5105%，高于表中最優(yōu)組合(A2B1C2D3)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(3.4318%)。因此，確定雙孢蘑菇多糖提取條件的最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即提取次數(shù)3次、水料比50 mL/g、提取時間4 h、提取溫度80℃。

2.6 雙孢蘑菇粗多糖的多糖含量及相對黏度

苯酚-硫酸法測量雙孢蘑菇粗多糖產(chǎn)品的多糖含量均值為71.84%。烏氏黏度計法測量雙孢蘑菇粗多糖產(chǎn)品在10 mg/mL、25℃條件下的相對黏度(相對于去離子水)為1.1096。

2.7 雙孢蘑菇粗多糖的紅外光譜

KBr壓片法掃描了雙孢蘑菇粗多糖的紅外光譜，結(jié)果如圖5所示。3 700～3 100 cm－1處出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收帶是羥基的O-H伸縮振動，3000～2800 cm－1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是烷基的C－H伸縮振動，這兩個吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征峰［17］，進(jìn)一步證明這種物質(zhì)是多糖類物質(zhì)。1200～900 cm－1處出現(xiàn)的一組強(qiáng)吸收峰是糖環(huán)的醚鍵(C-O-C)的伸縮振動和羥基的O-H變角振動［17］。1700 ～1600 cm－1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰可能是羧基的C=O非對稱伸縮振動，也可能是氨基的 N-H變角振動，還可能是水峰［17］，該吸收峰的具體歸屬有待于其他方法進(jìn)一步確認(rèn)。

圖5 雙孢蘑菇粗多糖的傅立葉變換紅外光譜圖

3 結(jié)論

雙孢蘑菇多糖的最優(yōu)提取條件為:提取溫度80℃、提取時間4 h、水料比50 mL/g、提取次數(shù)3次。使用此條件，多糖的提取率為3.510 5%。雙孢蘑菇粗多糖產(chǎn)品的多糖含量為71.84%。在10 mg/mL、25℃條件下，此粗多糖的相對黏度(相對于去離子水)為1.109 6。紅外光譜掃描了雙孢蘑菇粗多糖，多糖的特征吸收峰(3 700～3 100 cm－1和3 000～2 800 cm－1)清晰可見。

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Optimization of Extraction Parameters and Preliminary Feature of Polysaccharides from Sporocarp of Agaricus bisporus

Qiao De-liang1，2，Chen Nai-fu1，2，Zhang Li1，2，Chen Ke1，2
1(Department of Chemistry and Life Science，West Anhui University，Lu＇an 237012，China)2(Anhui Provincial Laboratory of Biomimetic Sensor and Detecting Technology，West Anhui University，Lu＇an 237012，China)

Polysaccharides from sporocarp of Agaricus bisporus was extracted by using methods of hot water lixiviation，ethanol precipitation，Sevag＇s deproteination and ethanol precipitation again.Extraction temperature，extraction time，ratio of water to raw material and extraction times were selected in single-factor tests.Based on the single-factor tests，combination of the extraction parameters was optimized by using four-factor-three-level orthogonal test.The optimum conditions were extracting temperature 80℃，extracting time 4 h，ratio of water to raw material 50 mL/g and extraction times 3.Practicing this optimal condition，extraction yield of polysaccharides from sporocarp of Agaricus bisporus was 3.510 5%.In crude polysaccharides of Agaricus bisporus sporocarp，carbohydrates content，determined by applying the phenol-sulfuric acid method，was 71.84%.Relative viscosity(to deionized water)，detected by using Ubbelohde viscosimeter，was 1.109 6 at temperature of 25℃ and concentration of 10 mg/mL.In FTIR spectrum obtained from KBr pellet method，characteristic absorptions(3 700～3 100 cm－1and 3 000～2 800 cm－1)of polysaccharides were observed clearly.

Agaricus bisporus，polysaccharides，extraction，orthogonal test，feature

博士，副教授。

*安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2010B256);六安市定向委托皖西學(xué)院市級研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2009LWA003)。

2010－07－20，改回日期:2010－11－04