許 杰,閆秋月,湛彥強(qiáng),張?zhí)K明

華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

#通訊作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干細(xì)胞再生與腦血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

小鼠微小 RNA294逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定＊

許 杰,閆秋月,湛彥強(qiáng),張?zhí)K明#

華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

#通訊作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干細(xì)胞再生與腦血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

微小RNA;細(xì)胞重編程;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;小鼠

目的:構(gòu)建小鼠微小 RNA294(miR-294)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。方法:從小鼠基因組 DNA擴(kuò)增 pri-miR-294,克隆連接至pMX-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上,得 pMX-miR-294-I RES-GFP,測(cè)序鑒定后以轉(zhuǎn)染 PLAT-E細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,測(cè)定病毒滴度。結(jié)果:pMX-miR-294-IRES-GFP經(jīng) PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定正確,并得到了滴度為 (1～5)× 106TU/mL的病毒液。結(jié)論:成功構(gòu)建了 pMX-miR-294-I RES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

微小RNA(microRNA,miRNA)和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是目前生物學(xué)領(lǐng)域的兩個(gè)前沿。研究[1]表明,miRNA在動(dòng)植物體內(nèi)參與調(diào)控干細(xì)胞特性,并參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡,在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。miRNA-290(miR-290)簇在小鼠胚胎干細(xì)胞多能性的維持方面發(fā)揮著重要作用,其中一些亞型對(duì)胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控起著無(wú)可替代的作用,包括miR-291-3p、miR-294和miR-295,故被稱(chēng)為胚胎干細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控特異性 miRNA[2]。iPSCs的誘導(dǎo)目前多側(cè)重于基因和轉(zhuǎn)錄因子的研究,至于miRNA在 iPSCs的誘導(dǎo)過(guò)程中是否發(fā)揮作用目前仍不清楚。作者構(gòu)建了miR-294逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,用于研究miR-294在 iPSCs誘導(dǎo)過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物與質(zhì)粒:孕 12.5 d昆明小鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;pMXI RES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由第四軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室韓驊教授惠贈(zèng)。細(xì)胞來(lái)源:PLAT-E細(xì)胞和N IH3T3細(xì)胞購(gòu)于廣州賽業(yè)生物科技有限公司,E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技有限公司。酶類(lèi)和試劑:限制性核酸內(nèi)切酶(NEB公司),小提質(zhì)粒提取試劑盒 (Omega公司),Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen公司),DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和 2.5 g/L胰蛋白酶 (Hyclone公司)。器材:細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo公司),恒溫?fù)u床 (華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司),PCR儀(Applied Biosystems公司),熒光顯微鏡 (Olympus公司)。

1.2 pri-m iR-294的 PCR擴(kuò)增 從 EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取 pri-miR-294的序列,應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)引物,送至 Invitrogen公司合成。上游 (mmu-miR-294-B amHⅠ-F):5’-CGGGATCCCCTAAGTGTTGCATCATTTG-3’;下 游 (mmu-miR-294-XhoⅠ-R): 5’-CCGCTCGAGGTTCCAGGAAACCTTCATC-3’。上下游引物中分別含有B amHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以小鼠基因組DNA為模板擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,30個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 5 min。純化并回收PCR產(chǎn)物。

1.3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 p M X-mmu-m iR-294-IRES-GFP的構(gòu)建和鑒定 純化后的 PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后再次純化得到 pri-miR-294片段。pMX-IRES-GFP空載體用B amHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收線(xiàn)性化空載體。取 1μL線(xiàn)性化載體(100 mg/L)與 1μL純化的 PCR產(chǎn)物 (100 mg/ L)在 T4 DNA連接酶作用下于 16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取少許菌落溶于 10μL LB培養(yǎng)液中混勻,取 1μL為模板,以引物 pBMN-5(位于多克隆位點(diǎn)的上游,5’-GCTTGGATACACGCCGC-3’)為上游引物,以 mmumir-294-XhoⅠ-R為下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s,60℃復(fù)性 30 s,72℃延伸 30 s,循環(huán) 30次;72℃延伸 6 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定;將陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng),提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的制備及病毒滴度的測(cè)定將 4×106個(gè) PLAT-E細(xì)胞[3]接種于多聚賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)瓶中,用無(wú)抗培養(yǎng)基 (體積分?jǐn)?shù) 90% DMEM高糖溶液,體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)。待 PLAT-E細(xì)胞融合度達(dá) 60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。一 EP管中加入 20μL脂質(zhì)體和 500μL OPTI,混勻靜置 5 min;另一 EP管中加入 8μg pMX-miR-294-IRES-GFP質(zhì)粒和 500μL OPTI,混勻靜置 5 min;然后將兩管混勻,靜置 20 min。將混合液轉(zhuǎn)移至 PLAT-E細(xì)胞的培養(yǎng)瓶(棄去原有培養(yǎng)基)中,再加無(wú)抗培養(yǎng)基 4 mL,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況。收集上清液。以孔徑為0.45μm的濾器過(guò)濾,收取約 5 mL病毒液,然后 4 000g離心至需要的病毒濃縮體積。將病毒濃縮液移出,分裝后 -80℃保存。采用逐孔稀釋滴度測(cè)定法進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。

1.5 病毒感染 NIH3T3細(xì)胞 用無(wú)抗培養(yǎng)基培養(yǎng)N I H3T3細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá) 30%左右時(shí)進(jìn)行感染。實(shí)驗(yàn)分為感染組和對(duì)照組,分別取1 mL病毒液和 PBS液,均加入 0.5μL 80 g/L的 polybrene(終濃度為 4 mg/L),感染組 N I H3T3細(xì)胞加入病毒液,對(duì)照組加入 PBS液,同等條件下感染 12 h后觀(guān)察。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果 以小鼠基因組為模板PCR擴(kuò)增 pri-miR-294,得到 501 bp的片段(圖 1)。

圖1 pri-m iR-294PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 pM X-mmu-m iR-294-IRES-GFP的鑒定 重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆 PCR產(chǎn)物大小為 564 bp(圖 2),測(cè)序報(bào)告顯示重組質(zhì)粒中插入的 pri-miR-294序列與GenBank中的序列一致。

圖2 陽(yáng)性克隆PCR結(jié)果

2.3 病毒滴度測(cè)定 PLAT-E細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 GFP的表達(dá)效率 >90%,結(jié)果見(jiàn)圖 3。病毒滴度為 (1～5)×106TU/mL。

2.4 NIH3T3細(xì)胞病毒感染后 GFP的表達(dá) 見(jiàn)圖4。

3 討論

2006年,Takahashi等[4]通過(guò)過(guò)表達(dá) 4種胚胎干細(xì)胞多能性基因 oct3/4、sox2、c-myc和 klf4,成功地將鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年鼠尾尖成纖維細(xì)胞逆向分化為 iPSCs;2007年,Takahashi等[5]和 Yu等[6]用同樣的方法獲得了人 iPSCs;之后,相繼出現(xiàn)了質(zhì)粒iPSCs[7]和蛋白質(zhì) iPSCs[8]等。但上述方法基本上都側(cè)重于基因和轉(zhuǎn)錄因子的研究,即都是通過(guò)外源表達(dá)胚胎干細(xì)胞多能性基因從而打開(kāi)內(nèi)源開(kāi)關(guān),使其逆向分化。2009年,Judson等[9]首次報(bào)道運(yùn)用 miRNA來(lái)誘導(dǎo) iPSCs,將 iPSCs的研究引入了一個(gè)新領(lǐng)域,但其研究仍然依賴(lài)于 oct4、sox2和 klf4 3個(gè)多能性基因的過(guò)表達(dá),單只應(yīng)用 miRNA能否誘導(dǎo)得到iPSCs至今仍是一個(gè)未知數(shù)。已發(fā)現(xiàn)與胚胎干細(xì)胞關(guān)系最密切的是miR-290簇,其占據(jù)了鼠胚胎干細(xì)胞全部 miRNA的 70%以上[10],包括 miR-290至miR-295。隨著鼠胚胎干細(xì)胞的分化,以上 miRNA的表達(dá)迅速下降,其中miR-291-3p、miR-294和miR-295對(duì)胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控起著無(wú)可替代的作用。

作者選擇了miR-294作為胚胎干細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控特異性miRNA,將其構(gòu)建在帶有 GFP標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMX-I RES-GFP上。常規(guī)研究 miRNA的方法多是將其miRNA構(gòu)建在一般的真核表達(dá)載體上,繼而通過(guò)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞研究其基因下調(diào)或上調(diào)功能。該研究中選擇的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,與其他類(lèi)型的外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式相比,其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,并且可持續(xù)表達(dá)。這與下一步運(yùn)用miRNA誘導(dǎo) iPSCs的需要是相符的,因?yàn)榧韧难芯縖11]表明,iPSCs至少需要 12 d外源基因的持續(xù)高表達(dá),所以如果選擇一般的真核表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染難以滿(mǎn)足 iPSCs誘導(dǎo)的需要。作者沒(méi)有選擇 pre-miRNA,而是將 primiRNA的基因序列構(gòu)建在載體上,這是因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體屬于整合型病毒載體,選擇 pri-miRNA更接近于生物體內(nèi)正常的miRNA的轉(zhuǎn)錄、剪切、出核及再剪切的成熟過(guò)程。所選用的 pMX-I RES-GFP載體上攜帶了一個(gè) GFP基因,這樣可以直觀(guān)監(jiān)測(cè)感染效率以及進(jìn)行流式篩選。

作者成功構(gòu)建了 pMX-miR-294-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,為下一步運(yùn)用miRNA來(lái)誘導(dǎo) iPSCs提供了可能,且為進(jìn)一步研究細(xì)胞重編程機(jī)制提供了一個(gè)平臺(tái)。

[1]王世華,邊春景,趙春華.microRNA在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)及作用[J].遺傳,2008,30(12):1545

[2]Wang Y,Baskerville S,ShenoyA,et al.Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation[J].Nat Genet,2008,40(12): 1478

[3]Morita S,Kojima T,Kitamura T.Plat-E:an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses[J]. Gene Ther,2000,7(12):1063

[4]Takahashi K,Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663

[5]Takahashi K,Tanabe K,OhnukiM,et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861

[6]Yu J,VodyanikMA,Smuga-Otto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells [J].Science,2007,318(5858):1917

[7]Okita K,NakagawaM,Hyenjong H,et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors [J].Science,2008,322(5903):949

[8]Zhou H,Wu S,Joo JY,et al.Generation of induced pluri potent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4(5):381

[9]Judson RL,Babiarz JE,VenereM,et al.Embryonic stem cell specific microRNAs promote induced pluripotency[J]. NatBiotechnol,2009,27(5):459

[10]Marson A,Levine SS,Cole MF,et al.Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells[J].Cell,2008,134(3):521

[11]Brambrink T,Foreman R,Welstead GG,et al.Sequential expression of pluripotencymarkers during direct reprogramming of mouse somatic cells[J].Cell Stem Cell,2008,2 (2):151

Construction and identification of embryonic stem cell-specific microRNA294 retroviral vector ofmice

XU Jie,YAN Q iuyue,ZHAN Yanqiang,ZHANG Sum ingDepartm ent of Neurology,Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology,W uhan 430030

microRNA;cellular reprogramming;retroviral vector;mouse

Ai m:To construct microRNA-294(miR-294)retroviral vector.Methods:pri-miR-294 amplified by PCR was inserted into pMX-IRES-GFP vector,and then identified by nucleotide sequencing.PLAT-E cellswere transfectedwith retroviral vector pMX-miR-294-IRES-GFP.All virus stockswere produced by calcium phosphate-mediated transfection.The titer of viruswas tested according to the expression level of GFP.Results:DNA sequencing demonstrated that pMX-miR-294-I RES-GFP was successfully constructed.The titer of concentrated viruswas(1～5)×106TU/mL.Conclusion:pMX-miR-294-IRES-GFP retroviral vectorwas successfully constructed,which paved the way for the induction of induced pluripotent stem cells and the investigation of cellular reprogrammingmechanism.

Q819

＊國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30370505;武漢市科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目 200860423216

(2009-12-25收稿 責(zé)任編輯徐春燕)