馬 晶,趙國強,朱 含,袁建黨,章 茜#,安玉會

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,女,1957年 10月生,博士,教授,研究方向:心律失常的分子機制,E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

酵母雙雜交系統(tǒng)檢測 SK2與 RyR2蛋白的相互作用＊

馬 晶1),趙國強1),朱 含2),袁建黨2),章 茜2)#,安玉會3)

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,女,1957年 10月生,博士,教授,研究方向:心律失常的分子機制,E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

小電導(dǎo) Ca2+激活 K+通道;肌漿網(wǎng);酵母雙雜交;相互作用

目的:探討小電導(dǎo) Ca2+激活 K+(SK)通道亞型 SK2通道與肌漿網(wǎng) (RyR)2蛋白的相互作用。方法:經(jīng)PCR擴增及酶切鑒定,構(gòu)建含有 SK2和 RyR2目的基因片段的酵母表達載體 pGBKT7-SK2和 pGADT7-RyR2。pGBKT7-SK2與 pGADT7-RyR2經(jīng)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母宿主 AH109,X-α-Gal/3AT/SD/-Trp-Leu培養(yǎng)鑒定陽性克隆。結(jié)果:獲得 3個重組質(zhì)粒 pGBKT7-SK2和 16個重組子 pGADT7-RyR2。酵母雙雜交檢測結(jié)果顯示 pGBKT7-SK2與pGADT7-RyR2可轉(zhuǎn)化酵母AH109,但無陽性菌落生長。結(jié)論:SK2和 RyR2蛋白之間可能無直接相互作用。

小電導(dǎo) Ca2+激活 K+(small-conductance calcium-activated potassium channel,SK)通道有 4種不同的亞型,分別為 SK1、SK2、SK3和 SK4通道[1]。人和小鼠的心肌組織存在 SK2通道,參與心肌細胞動作電位 (action potential,AP)復(fù)極化的構(gòu)成[2-3]。SK通道是依賴于細胞內(nèi) Ca2+激活的 K+通道,其鈣源主要來自細胞膜 L-Ca2+通道,部分可能與肌漿網(wǎng)(ryanodine receptor,RyR),即 Ca2+釋放通道有關(guān)[4]。作者之前的工作首次驗證了心肌 SK2通道與 RyR2(心臟 RyR型受體)為一功能復(fù)合體,具有相互作用[3]。為進一步探討 SK2的功能,作者采用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測了 SK2蛋白與 RyR2蛋白之間是否存在直接相互作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 酵母菌株 AH109、酵母表達載體pGBKT7及pGADT7、酵母培養(yǎng)基 YPD、缺陷型培養(yǎng)基 SD/-Trp-Leu和 SD/-Trp為Clontech公司產(chǎn)品; DH5α大腸桿菌菌株為鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存;含有完整的小鼠 RyR2 cDNA質(zhì)粒由 Ray博士 (加拿大卡爾加里大學(xué))惠贈;含有完整的小鼠 SK2 cDNA質(zhì)粒購自O(shè)riGene Technologies公司。

1.2 工具酶與試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自 Promega公司;EcoRⅠ內(nèi)切酶、NdeⅠ內(nèi)切酶、BamHⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和X-α-Gal購自 TaKaRa公司;凝膠回收純化試劑盒購自Axygen公司;常規(guī)分子生物學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純或進口分裝。

1.3 目的基因片段的亞克隆 使用 DNASTAR、DNASIS和VectorNTIAdvance等軟件,并參考文獻[5]綜合分析 SK2蛋白結(jié)構(gòu)域,將 SK2分為 3個片段,分別包含N-末端、C-末端和跨膜區(qū)。參閱文獻[6]綜合分析 RyR2蛋白結(jié)構(gòu)域,將RyR2分成 16個片段。根據(jù) GenBank SK2基因 (I D BC125475)和RyR2基因序列 (I D NM_023868)分別設(shè)計引物,由上海博興生物公司合成。采用 PCR擴增、膠回收純化 RyR2 16個目的基因片段和 SK2 3個目的基因片段,分別與 T載體連接,形成重組子轉(zhuǎn)化DH5α,對篩選出的陽性克隆進行DNA測序分析。

1.4 線性雙黏 pGBKT7和 pGADT7載體重組及鑒定[7]將3個 SK2雙黏目的基因片段分別與線性雙黏pGBKT7載體重組;將 16個 RyR2雙黏目的基因片段分別與線性雙黏 pGADT7載體重組。重組子 pGBKT7-SK2用EcoRⅠ/NdeⅠ雙酶切鑒定, pGADT7-RyR2用EcoRⅠ、B amHⅠ/N deⅠ和B amHⅠ雙酶切鑒定。

1.5 酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化 從 YPDA平板上挑取AH109單克隆,接入 YPDA液體培養(yǎng)基,經(jīng)重懸、洗滌及離心沉淀獲得感受態(tài)酵母細胞。分別將 pGBKT7-SK2和 pGADT7-RyR2電轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細胞AH109,涂布 X-α-Gal/SD/-Trp平板培養(yǎng)。藍色菌落表明對酵母細胞有激活能力。

1.6 酵母雙雜交實驗 將 3個酵母表達載體 pGBKT7-SK2分別與 16個表達載體 pGADT7-RyR2進行組合,兩兩配對(共 48對),采用山梨醇電轉(zhuǎn)化法將 48個配對分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母 AH109,點于X-α-Gal/3-AT/SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基,30℃倒置培養(yǎng)3 d。同時以含有 pGBKT7-53/pGADT7-T的酵母菌AH109點種作為對照。若上述轉(zhuǎn)化酵母菌落生長且變藍,說明轉(zhuǎn)化子之間有相互作用;若為白色菌落生長,說明兩轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入核內(nèi),但無相互作用。

2 結(jié)果

2.1 酵母表達質(zhì)粒 pGBKT7-SK2的構(gòu)建結(jié)果 經(jīng)PCR擴增,獲得 3個 SK2目的基因片段,分別為411、729和 546 bp。將 3個目的基因分別克隆至 T載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,篩選出的陽性克隆測序結(jié)果與 GenBank中報道的 SK2序列一致。3個重組子與 pGBKT7連接,經(jīng)酶切鑒定,得到重組酵母表達載體 pGBKT7-SK2441、pGBKT7-SK2729和 pGBKT7-SK2546(圖 1)。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7-SK2雙酶切圖

2.2 酵母表達質(zhì)粒 pGADT7-RyR2的構(gòu)建結(jié)果經(jīng) PCR擴增,獲得 16個 RyR2目的基因片段: 1 159、1 166、1 186、1 203、1 062、814、1 235、1 693、1 070、1 104、1 049、662、870、1 006、845和 684 bp。分別將 16個RyR2目的基因片段亞克隆至 T載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,經(jīng)酶切篩選陽性克隆測序,結(jié)果與 GenBank報道的 RyR2序列完全一致。將 16個重組子 RyR2-T所含的目的基因片段分別克隆到pGADT7酵母表達載體,經(jīng) PCR和酶切鑒定獲得重組 質(zhì) 粒:pGADT7-RyR21159、pGADT7-RyR21166、pGADT7-RyR21186、 pGADT7-RyR21203、 pGADT7-RyR21062、 pGADT7-RyR2814、 pGADT7-RyR21235、pGADT7-RyR21693、 pGADT7-RyR21070、 pGADT7-RyR21104、 pGADT7-RyR21049、 pGADT7-RyR2662、pGADT7-RyR2870、 pGADT7-RyR21006、 pGADT7-RyR2845和 pGADT7-RyR2684(圖 2)。

2.3 酵母雙雜交實驗結(jié)果 AH109于 X-Gal缺陷型培養(yǎng)基上無藍色菌落生長。pGADT7-RyR2/pGBKT7-SK2配對分別轉(zhuǎn)化入酵母 AH109,48個培養(yǎng)組菌落均為白色,而對照菌落為藍色,說明 SK2蛋白與RyR2蛋白之間無直接相互作用。

圖2 重組質(zhì)粒pGADT7-RyR2酶切鑒定

3 討論

SK2通道是位于細胞膜上的 K+通道蛋白,通過膜電位與 Ca2+整合而參與AP的構(gòu)成,影響 AP復(fù)極化末期,而此期相當(dāng)于心肌細胞興奮性的相對不應(yīng)期和超常期,涉及臨床心律失常發(fā)生的重要機制[8-9]。然而,對心肌 SK通道的作用機制及其相關(guān)分子,少有報道。

作者前期工作[3]表明,天然心肌組織中 SK2與RyR2之間可能具有相互作用,為進一步探討 2者間是否存在直接相互作用,該研究以酵母雙雜交系統(tǒng)進行了檢測。作者首先采用酵母雙雜交系統(tǒng)對 SK2與RyR2蛋白之間的相互作用進行了初步的探討。經(jīng) PCR擴增3個 SK2和16個RyR2目的基因片段,成功構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒 pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2。作者所采用的酵母菌株 AH109含有 3種報告基因:Ade2、His3和Mel1(或 LacZ),研究中應(yīng)用X-α-Gal來檢測報告基因的激活情況。結(jié)果表明酵母表達質(zhì)粒本身不具有自激活效應(yīng),故可用于該雙雜交系統(tǒng)模型。酵母雙雜交實驗結(jié)果表明 SK2與RyR2蛋白之間并沒有直接相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在真核細胞酵母內(nèi)檢測蛋白與其他研究蛋白相互作用的方法,得到的結(jié)果可能與天然情況相似[10-11]。但是,該技術(shù)也存在著某些缺陷,它不能檢測所有的蛋白與蛋白之間的相互作用。對于在細胞內(nèi)不能正確折疊以及不能轉(zhuǎn)移到核內(nèi)的蛋白不能檢測[12]。此外,對于那些發(fā)生在膜上的相互作用的蛋白,可能由于環(huán)境的不同而使它們不能形成正確的構(gòu)象[10,12],導(dǎo)致在酵母細胞核中不發(fā)生相互作用,故對這類蛋白的檢測也可能出現(xiàn)假陰性。SK2及 RyR2都屬于膜蛋白,采用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測它們是否存在直接的相互作用,尚不能完全排除上述因素的影響。因此,SK2與 RyR2之間是否具有功能上的相互作用,有待用其他技術(shù)進一步證實。

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Identification of interaction bet ween SK2 and RyR2 protein by yeast twohybrid system

MA Jing1),ZHAO Guoqiang1),ZHU Han2),YUAN Jiandang2),ZHANG Q ian2),AN Yuhui3)1)Departm ent of M icrobiology and Imm unology,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University, Zhengzhou 4500012)Depart m ent of Physiology,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500013)Departm ent of B iochem istry and M olecularB iology,College of B asic M edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

s mall-conductance calcium-activated potassium channel;ryanodine receptor;yeast two-hybrid;interaction

Ai m:To detect the interaction of s mall-conductance calcium-activated potassium channel(SK)2 with ryanodine receptor(RyR)2.Methods:The yeast expressive plasmid pGBKT7 vectors containing target fragments of SK2 gene and the pGADT7 vectorswith the fragments of RyR2 gene were individually constructed by PCR and restricted endonuclease.The recombinants of pGBKT7-SK2 and pGADT7-RyR2 were co-transfor med into yeastAH109 by electrophoration and inoculated into the X-α-Gal/3AT/SD/-Trp-Leu plate.The positive colonies in the plateswere screened by X-α-Gal color. Results:Three recombinants of pGBKT7-SK2 and sixteen recombinants of the pGADT7-RyR2 vectors were successfully constructed and transfor med into the yeast hostAH109.But no positive clonies in the plates were identified.Conclusion: The interaction of SK2 with RyR2 protein has not been detected in the yeast.

R310.21

＊國家自然科學(xué)基金資助項目 30870909

(2010-08-05收稿 責(zé)任編輯姜春霞)