趙 敏，譚鋼文，唐小異，龍靈芝，周 源

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginos，PAE)為醫(yī)院內(nèi)重要的條件致病菌之一，人體免疫力低下時(shí)，如長(zhǎng)期應(yīng)用激素類(lèi)藥物、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、嚴(yán)重創(chuàng)傷或醫(yī)療操作如氣管切開(kāi)等，更容易感染PAE菌且死亡率高[1-2]。廣譜抗生素的大量應(yīng)用使銅綠假單胞菌耐藥率增高，給臨床治療帶來(lái)困難[3-4]。二十世紀(jì)80年代開(kāi)始，中草藥作為天然、毒、副作用小的細(xì)菌耐藥性抑制劑，顯示了良好的應(yīng)用前景。黃連具廣譜抗菌活性，黃芪是常見(jiàn)的益氣健脾中藥之一，具有明顯的提高機(jī)體免疫和促進(jìn)腸胃功能等作用[5-6]。本研究對(duì)黃連等10種中藥材進(jìn)行常規(guī)提取，觀(guān)察各提取物處理后，抗生素對(duì)銅綠假單胞菌抑制作用的變化。

1 材料與方法

1.1 藥品

氨芐西林鈉注射液(1.0g/支，哈藥集團(tuán)制藥總廠(chǎng)，批號(hào) A080515713)、頭孢他啶注射液(1.0g/支，山西威奇達(dá)藥業(yè)有限公司，批號(hào) 20081209)。黃柏、黃芩、槐花、連翹、防己、黃連、苦參、穿心蓮、蛇床子、麻黃等中藥購(gòu)自湖南高橋大市場(chǎng)藥材公司亞飛經(jīng)營(yíng)部并經(jīng)本院生藥室鑒定。

1.2 菌種及儀器

耐藥銅綠假單胞菌由本院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；Tu-1800SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，YC7124真空泵，HH-S恒溫水浴鍋，YXQ-2S-S0S1高壓蒸汽滅菌器，METTLER TOLEDO PL403電子精密天平；YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器，eppendorf 5804R冷凍離心機(jī)，PYX-150S-A生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F凈化工作臺(tái)。

1.3 方法

1.3.1 中草藥提取物的制備

黃芩、黃芪、槐花、連翹、防己等采用乙醇回流法制備：中藥材經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎，過(guò)100目篩，各稱(chēng)取50 g，加50%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，重結(jié)晶后溶于蒸餾水，濃縮(相當(dāng)于原藥0.5 g/mL)、高壓蒸汽滅菌，編號(hào)后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。黃柏采用堿提法，常壓加熱煎煮法制備黃連、麻黃、苦參、蛇床子、穿心蓮提取物，濃縮至1:1(相當(dāng)于1 g/mL)，十種中藥提取物經(jīng)無(wú)菌濾紙濾過(guò)、除菌，裝瓶4℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.3.2 平板打孔法測(cè)定銅綠假單胞菌對(duì)抗生素、中藥提取物的敏感性

將銅綠假單胞細(xì)菌劃線(xiàn)接種于瓊脂培養(yǎng)平板上，分別加入稀釋濃度為1 g/mL的氨芐西林、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星注射液，十種中藥提取物，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀(guān)察有無(wú)抑菌環(huán)。以平板打孔法定性測(cè)試藥物對(duì)銅綠假單胞細(xì)菌有無(wú)抑制作用。

1.3.3 對(duì)倍稀釋法測(cè)定抗生素的最小抑菌濃度

取10個(gè)透明離心管，各加入2 mL MH液體培養(yǎng)基，往1號(hào)管中加入一定濃度的抗生素溶液，震蕩均勻后吸取2 mL加入2號(hào)管，依次類(lèi)推至10號(hào)管震蕩均勻后，吸取2 mL棄去，加入稀釋菌液50 μL，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，測(cè)定多次二倍梯度稀釋后，各抗生素對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC 1)。

1.3.4 中藥提取液對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度

取10個(gè)透明離心管，分別加入1 mL對(duì)應(yīng)的中藥和1 mL MH液體培養(yǎng)基，加入稀釋菌液50 μL，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，離心后取沉淀，加MH培養(yǎng)基稀釋。發(fā)現(xiàn)黃芩、連翹藥液培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，測(cè)黃芩和連翹提取物的最小抑菌濃度(MIC 2)。

1.3.5 平板打孔法定性檢測(cè)中藥處理后是否恢復(fù)耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性

用10個(gè)MH平板分別涂上原菌或經(jīng)中藥處理的銅綠假單胞菌，每板打三個(gè)孔，分別標(biāo)記為阿米卡星、氨芐西林和頭孢他啶，加入對(duì)應(yīng)的抗生素溶液100 μL。37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀(guān)察抑菌環(huán)大小，確定中藥是否恢復(fù)了細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。

1.3.6 二倍梯度稀釋法比較抗生素對(duì)經(jīng)10種中藥處理菌與原菌的最小抑菌濃度

從1.3.4得到可使抑菌環(huán)增大的中藥和/或抗生素的組合，加入的菌液按10種中藥培養(yǎng)菌和原菌分為11個(gè)組。培養(yǎng)后觀(guān)察各管中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，確定各組藥物的抗菌作用(MIC 3)，反復(fù)以二倍梯度稀釋法觀(guān)察中藥單用或與抗生素合用后MIC的變化。

2 結(jié)果

2.1 單用中藥提取物的抗銅綠假單胞菌作用

平板打孔法測(cè)定，分別單獨(dú)加入黃柏、槐花、防己、黃連、苦參、穿心蓮、蛇床子、麻黃等中藥提取物的培養(yǎng)基均無(wú)抑菌環(huán)出現(xiàn)，提示以上中藥的提取物單用對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)明顯抑制作用。

2.2 單用抗生素對(duì)抗銅綠假單胞菌作用

二倍梯度稀釋法測(cè)定，阿米卡星、氨芐西林和頭孢他啶對(duì)耐藥銅綠假單胞菌有抑制作用，最小抑菌濃度分別為0.050，0.008，0.001 g/mL，頭孢他啶抑菌作用最強(qiáng)。而慶大霉素原濃度藥液(1mL:4萬(wàn)單位)也不能抑制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)棄用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗生素對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(g/mL)

2.3 二倍梯度稀釋法測(cè)定黃芩和連翹提取物的最小抑菌濃度

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物經(jīng)三次二倍稀釋、連翹提取物經(jīng)四次二倍稀釋后，仍可產(chǎn)生抗菌作用。結(jié)果見(jiàn)表2。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用0.125 g/mL黃芩或0.1125 g/mL連翹處理細(xì)菌培養(yǎng)基。

表2 黃芩和連翹提取物對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(g/mL)

2.4 平板打孔法測(cè)試十種中藥的提取物分別與抗生素、氨芐西林或頭孢他啶合用后，是否恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，測(cè)得抑菌環(huán)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 氨芐西林、頭孢他啶單用或與中藥提取物合用后的抑菌環(huán)直徑

結(jié)果顯示，氨芐西林和頭孢他啶對(duì)黃芩、連翹、黃連、穿心蓮、麻黃5種中藥處理后，抑菌環(huán)直徑大于單用一種抗生素產(chǎn)生的抑菌環(huán)(單用氨芐西林1.8 cm，單用頭孢他啶4.5 cm)，提示以上5種中藥可增加銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林和頭孢他啶的敏感性。

2.5 經(jīng)反復(fù)進(jìn)行二倍梯度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定最小抑菌濃度

結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩處理后，氨芐西林對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度降為0.004 g/mL，為單用時(shí)MIC(0.008 g/mL)的一半。而頭孢他啶經(jīng)15次二倍稀釋后仍呈現(xiàn)抗菌活性，最小抑菌濃度由單用時(shí)0.001g/mL降為3.87×10-6g/mL；經(jīng)黃連處理后，亦得到類(lèi)似結(jié)果。提示黃芩或黃連可提高銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林的敏感性，黃芩或黃連可明顯提高銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶的敏感性。見(jiàn)表4。

表4 黃芩、黃連和抗生素合用后的最小抑菌濃度(g/mL)

3 討論

銅綠假單胞菌對(duì)多種常用的抗菌藥物耐藥率較高，呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生多種滅活酶、外膜孔蛋白OprD2的缺失、外膜的通透性降低以及主動(dòng)外排泵機(jī)制等。因銅綠假單胞菌具有多藥耐藥性的特點(diǎn)，故治療其所致感染可供選擇的有效抗菌藥物甚少[8]。用于逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的中藥多為清熱解毒、利濕通淋類(lèi)藥物，如黃芪、黃柏、黃連、金銀花、馬齒莧、射干、大黃、五倍子、蒼術(shù)、石芽茶等以及相應(yīng)的復(fù)方制劑，如黃連解毒湯、三黃片、止痢靈等。近年的研究報(bào)道，黃芩、黃連、黃柏、連翹和千里光對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶菌株均有不同程度的抑制作用，黃芩抑菌效果較好，其次為黃連和千里光等[9]。最近研究報(bào)道，銅綠假單胞菌具有極強(qiáng)的生物膜形成能力，生物膜的形成可明顯降低其對(duì)抗菌藥物的敏感性甚至產(chǎn)生耐藥，常給臨床治療帶來(lái)很多困難，黃芩苷可抑制和破壞生物膜，并增強(qiáng)頭孢他啶對(duì)生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌的抗菌活性。本研究采用平板打孔法及二倍梯度稀釋法研究了10種中藥提取物對(duì)銅綠假單胞菌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩、黃連處理后，氨芐西林和頭孢他啶對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度顯著降低，提示黃芩、黃連與以上抗生素合用有協(xié)同抗菌作用，作用機(jī)理是否與影響銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)或功能有關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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