金 陽,張玉泉

(1.江蘇省常州市婦幼保健院婦產(chǎn)科,江蘇常州,213000;2.江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇南通,226000)

由于腫瘤細(xì)胞的失控性生長導(dǎo)致耗氧量的增加,缺氧成為腫瘤細(xì)胞生長的基本環(huán)境,腫瘤細(xì)胞如何適應(yīng)這一微環(huán)境并保持持續(xù)生長已成為腫瘤研究的中心問題。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,由HIF-1α和HIF-1β亞基組成,HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位,決定HIF-1的活性[1],而HIF-1直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的表達(dá),是惡性腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的主要調(diào)控因子。西羅莫司(SRL)是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提取出的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,研究顯示SRL不僅有抗移植免疫排斥反應(yīng)作用,而且還有廣泛的抗腫瘤作用[2-3]。本文用氯化鈷(CoCl2)化學(xué)模擬誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞內(nèi)缺氧,再加不同濃度SRL培養(yǎng),觀察細(xì)胞內(nèi)mTOR、HIF-1α表達(dá)變化,并對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa株(湘雅中心實(shí)驗(yàn)室);西羅莫司(SLR,上海寶曼生物科技有限公司);DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國 Invitrogen公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RISOTM RNA ISOlation Reagent、EzOmicsTM RNA i-step qPCR Kit(百奧邁科生物技術(shù)有限公司);兔抗人mTOR多克隆抗體(Bioworld公司);兔抗人 HIF-1α多克隆抗體(博士德公司);CCK8細(xì)胞增殖毒性試劑盒;PCR引物及GAPD H內(nèi)參(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基,37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后,傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,選擇生長良好的肝癌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組用培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,實(shí)驗(yàn)組用培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,用含不同濃度CoCl2的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h,根據(jù)CoCl2濃度不同分為 5個(gè)亞組(0、25、50 、100 和 150 μ mol/L 組);選擇CoCl2 濃度為100μ mol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境 ,用培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,實(shí)驗(yàn)組用含SRL 分別為 0、10、100、500、1 000 nmol/L的1 μ mol/L的CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.4 RT-PCR法測定經(jīng)CoCl2處理后,各組細(xì)胞中HIF-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)量

應(yīng)用熒光定量PCR儀MyIQ(Bio-Rad公司)做 RT-PCR分析。用 RISOTM RNA ISOlation Reagent提取總的 RNA。用 EzOmicsTM RNA i-step qPCR Kit一步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)擴(kuò)增磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。HIF-1α引物序列(107 bp):上游5′-GCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3′, 下 游 5′ -TGCAGTAGGTTTCTGCTGCC-3′;GAPDH 引物序列(225 bp):上游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下 游 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)體系為 25 μ L:RNA 5μ L,2 × Master Mix 12.5 μ L,Primer F′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,Primer R′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,DEPC-treated H2O6μ L 。 一步法PCR條件:42℃反轉(zhuǎn)錄60 min;95℃預(yù)變性10 min;95℃20 s,55℃20 s,72℃30 s,45個(gè)循環(huán);擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析程序:95℃1 min、55℃1 min,然后逐漸升至95℃(溫度轉(zhuǎn)換率為0.1℃/s,持續(xù)收集熒光數(shù)據(jù))。選擇適宜的基線,各熒光曲線和基線的交叉點(diǎn)即為Ct(cycle threshold)值,Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比,樣品中起始模板數(shù)越多,PCR越快進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增期,Ct越小。采用“比較 Ct值法”(Ct)分析熒光定量數(shù)據(jù),按照 Livak和Schimittgen設(shè)計(jì)并推導(dǎo)出的公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量=2—Ct,其中Ct=(Ct目的基因-CtGAPDH)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct-GAPDH)對(duì)照組,可計(jì)算出處理組基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.5 CCK-8法測定缺氧條件下SLR作用于Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞活力

收集處于對(duì)數(shù)生長期的 Ishikawa細(xì)胞接種于一次性96孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,次日待細(xì)胞貼壁后加入濃度為100 μ mol/L 的 CoCl2和不同濃度的 SLR(10、100、500、1 000 nmol/L),終末體積為 100 μ L,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每塊96孔板上另接種1孔只加培養(yǎng)液調(diào)零。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入同一批次的CCK-8作用2 h。選擇450 nm波長,調(diào)零后在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(D值),按公式細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均D值/對(duì)照組平均D值)×100%,計(jì)算SLR作用于缺氧條件下的Ishikawa細(xì)胞的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 FQ-PCR測定缺氧條件下SRL作用于各組細(xì)胞內(nèi)的mTOR、HIF-1α、mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

應(yīng)用熒光定量PCR儀MyIQ(Bio-Rad公司)做實(shí)時(shí)定量 PCR分析。用 RISOTM RNA ISOlation Reagent提取總的 RNA。用 EzOmic-sTM RNA i-step qPCR Kit一步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)擴(kuò)增磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。HIF-1α引物序列(107 bp):上游 5′-GCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3′,下游5′-TGCAGTAGGTTTCTGCTGCC-3′;mTOR 引物序列(133 bp):上游 5′-AGCGAGGAGCTGA TCCGAGT-3′,下游 5′-TAGCATGCAAGGG CTCCAGC-3′;GAPDH 引物序列(225bp):上游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′, 下游5′-GAAGATGGTGATGGGAT TTC-3′。 PCR反應(yīng)體系為 25 μ L:RNA 5 μ L,2 ×Master Mix 12.5 μ L,Primer F′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,Primer R′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,DEPC-treated H2O6μ L。一步法PCR條件:42℃反轉(zhuǎn)錄60 min;95℃預(yù)變性10 min;95℃20 s,55℃20 s,72℃30 s,45個(gè)循環(huán);擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析程序:95℃1 min、55℃1 min,然后逐漸升至95℃(溫度轉(zhuǎn)換率為0.1℃/s,持續(xù)收集熒光數(shù)據(jù))。計(jì)算方法同1.4。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量CoCl2對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

HIF-1α mRNA 在 0、25、50、100 和 150 μ mol/L的CoCl2處理組表達(dá)強(qiáng)度分別為1.00±0.08 、3.48±0.56、6.59±0.13、14.66±0.69 、15.76±0.88,隨著 CoCl2的濃度的升高 HIF-1α mRNA表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中 CoCl2濃度為 100和 150 μ mol/L 的兩組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.163;P>0.05),因此選用100 μ mol/L模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境。FQ-PCR檢測HIF-1α基因及內(nèi)參照基因GAPDH的融解曲線和擴(kuò)增曲線。

2.2 CCK-8法測定缺氧條件下SLR對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

不同濃度(10、100、500、1000 nmol/L)的SLR對(duì)Ishikawa細(xì)胞的抑制率(圖1)分別為:(38.95±1.89)%、(48.38±6.4)%、(65.65±0.90)%和(68.12±2.87)%。SLR對(duì)Ishikawa細(xì)胞有抑制作用,且其抑制率隨藥物濃度的增加而上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 缺氧條件下SLR對(duì)Ishikawa細(xì)胞的抑制率

2.3 不同劑量的SRL對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞中 mTOR,HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

mTOR mRNA 在含 SRL 分別為0、10、100、500、1 000 nmol/L 的 100 μ mol/L 的 CoCl2培養(yǎng)液處理組中的表達(dá)強(qiáng)度分別為1.18±0.30、0.87±0.12、0.85±0.11 、0.56±0.06、0.27 ±0.04;在常規(guī)培養(yǎng)條件下表達(dá)強(qiáng)度為1.00±0.20。HIF-1α mRNA 在含 SRL 分別為 0、10、100 、500、1 000 nmol/L的100 μ mol/L的CoCl2培養(yǎng)液處理組中的表達(dá)強(qiáng)度分別為5.20±0.96、4.19±0.42、3.71±0.59、3.41±0.31和2.68±0.16;在常規(guī)培養(yǎng)條件下表達(dá)強(qiáng)度為1.00±0.10。mTOR mRNA在缺氧對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)于常氧對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.743;P>0.05);常氧組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)較弱,缺氧對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在缺氧條件下,在不同藥物濃度組中,隨著SRL作用濃度的增加,HIF-1α、mTOR mRNA的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì),且抑制作用與藥物濃度顯著相關(guān)(P<0.05)。當(dāng)SRL的作用濃度達(dá)1 000 nmol/L時(shí),SRL對(duì)mTOR和HIF-1α mRNA的抑制效應(yīng)達(dá)到最大。FQ-PCR檢測 mTOR、HIF-1α基因及內(nèi)參照基因GAPDH的融解曲線和擴(kuò)增曲線。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是起源于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤,是婦科生殖道最常見的惡性腫瘤之一,現(xiàn)在許多國家,內(nèi)膜癌發(fā)病率已超過宮頸癌而躍居女性生殖道惡性腫瘤的首位。目前,治療子宮內(nèi)膜癌的方法以手術(shù)治療為主,輔以激素治療、化療、放療等。早期子宮內(nèi)膜癌以手術(shù)治療為主,治愈率達(dá)70%。晚期和復(fù)發(fā)性的子宮內(nèi)膜癌以激素及化療等姑息治療為主。然而治療效果仍不夠理想,因此,十分有必要探求一種新型的治療方法,以改善子宮內(nèi)膜癌的臨床結(jié)局。

HIF-1是在研究紅細(xì)胞生成素(EPO)基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子[4]。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控著下游眾多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子[5],由HIF-1α和HIF-1β亞基組成異源二聚體的轉(zhuǎn)錄因子,其中HIF-1α是主要活性單位,其表達(dá)受氧分壓調(diào)節(jié)HIF-1α感受缺氧信號(hào)后,自身被迅速激活,進(jìn)入核內(nèi)與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用并結(jié)合到缺氧相關(guān)基因的調(diào)控元件,調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),以維持細(xì)胞和機(jī)體的氧自穩(wěn)平衡能量代謝平衡。而缺氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境之一,所以HIF-1α對(duì)于腫瘤的生長尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)研究基于化學(xué)缺氧劑劑量準(zhǔn)確可控、不要特殊設(shè)備、易操作等優(yōu)點(diǎn),以CoCl2化學(xué)缺氧模擬細(xì)胞內(nèi)缺氧微環(huán)境,這里CoCl2的作用與低氧一致,Co2+是亞鐵螯合酶的底物,可取代細(xì)胞中的Fe2+與血紅素結(jié)合,使原卟啉 Ⅸ與O2分子的結(jié)合能力下降,阻斷O2信號(hào)的傳遞 ,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境處于缺氧狀態(tài),誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)。同時(shí),Co 2+還能通過替代作為脯氨酰羥化酶(PHD)輔助因子的Fe2+,抑制PHD對(duì)HIF-1α的羥基化作用,減少HIF-1α的降解[6]。本研究結(jié)果顯示 ,利用低濃度的CoCl2預(yù)處理細(xì)胞,HIF-1α的表達(dá)隨著缺氧程度的增高而增強(qiáng) ,提示無論在常氧還是低氧條件下,HIF-1α在人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中均有表達(dá) ,且隨著Co-Cl2濃度的增高,即缺氧信號(hào)的加強(qiáng)(實(shí)質(zhì)性腫瘤發(fā)展越快,氧供的不平衡就越明顯),其mRNA表達(dá)水平上調(diào)。因此,我們認(rèn)為一方面CoCl2是一種較好的模擬缺氧復(fù)氧的藥物[7],另一方面也說明本研究成功地復(fù)制了缺氧模型。其可能的機(jī)制為:當(dāng)氧需求量絕對(duì)或相對(duì)增加,腫瘤細(xì)胞可通過啟動(dòng)缺氧應(yīng)答的開關(guān)“HIF-1”,使其表達(dá)上調(diào),最終啟動(dòng)一系列下游基因轉(zhuǎn)錄,其產(chǎn)物使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的應(yīng)激狀態(tài)繼續(xù)存活和增殖。

SLR是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物,具有抗真菌和增強(qiáng)免疫抑制活性的作用 ,目前作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床。最近研究結(jié)果顯示,SRL具有廣泛的抗腫瘤作用 ,如抗胰腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腎癌等。SLR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)是mTOR,它進(jìn)入細(xì)胞后與FKBP12結(jié)合,形成一種“功能獲得性”復(fù)合物-rapamycin/FKBP12,強(qiáng)烈抑制mTOR的蛋白激酶催化活性,使之對(duì)其下游底物的磷酸化調(diào)節(jié)作用減弱或消失[8-10]。SLR阻斷mTOR信號(hào)途徑后,可使15%～20%的蛋白翻譯受到抑制并干擾細(xì)胞周期蛋白產(chǎn)物的表達(dá)和細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性,使細(xì)胞周期在G1后期-S期被阻斷從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。SRL通過特異性抑制mTOR而抑制HIF-1α的激活,可有效下調(diào)HIF-1α基因的表達(dá),既能抑制HIF-1α基因的合成又能增加其降解,并能下調(diào)HIF-1α基因調(diào)控的其他基因的表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SRL對(duì)Ishikawa細(xì)胞有生長抑制作用,能明顯使Ishikawa 細(xì) 胞 mTOR,HIF-1α mRNA 表 達(dá) 下降,且隨著 SRL濃度的升高,Mtor、HIF-1α mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)。由此推測,SRL可以通過上述信號(hào)途徑 ,阻斷 Ishikawa細(xì)胞表達(dá)HIF-1α mRNA,進(jìn)而抑制其下游基因VEGF等的表達(dá),從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,這可能是其抗腫瘤的機(jī)制之一。

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