劉若男 王莉莉 王莉英 李秀榮 張靖 陳奎生

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，由于卵巢癌發(fā)病隱匿，患者臨床明確診斷時(shí)大多數(shù)已經(jīng)是晚期，嚴(yán)重影響患者的生命健康。Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白家族(IAPs)成員，與Caspase結(jié)合發(fā)揮抗凋亡作用，其在正常成人組織中低或無表達(dá)，在某些惡性腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高表達(dá)，該基因可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化SP法檢測Livin蛋白和Caspase蛋白在良、惡性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)，旨在探討Livin和Caspase在卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為臨床治療及提高患者的生存率提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河南省腫瘤醫(yī)院病理科保存的2006年1月至2008年3月原發(fā)性上皮性卵巢腫瘤石蠟標(biāo)本100例，臨床資料完整。其中惡性腫瘤76例，作為卵巢癌組，年齡24～72歲，平均年齡(52.80±8.45)歲，術(shù)前均未接受過化療或放療。組織學(xué)分型:漿液性囊腺癌46例，粘液性囊腺癌24例，子宮內(nèi)膜樣腺癌6例。惡性卵巢腫瘤按FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)(1988年):I期8例，II期16例，III期44例，IV期8例。組織學(xué)分級:高分化(G1)20例，中分化(G2)30例，低分化(G3)26例。另取良性卵巢上皮性腫瘤24例作為對照組，其中漿液性囊腺瘤18例，粘液性囊腺瘤6例。

1.2 方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法(SP法)。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判定 參照文獻(xiàn)[2]，光學(xué)顯微鏡下 Livin及Caspase-3免疫組化產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，定位于胞質(zhì)，偶見于胞核。隨機(jī)觀察清晰的10個(gè)高倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占視野所有腫瘤細(xì)胞的百分比計(jì)算出每例標(biāo)本的Livin及Caspase-3表達(dá)率。根據(jù)其表達(dá)率及染色強(qiáng)度分別記為:(-)無明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞或陽性細(xì)胞面積小于10%，染色淺;(+)陽性細(xì)胞面積大于10%，但小于50%，染色較深;(++)陽性細(xì)胞面積大于50%，染色深。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)，分析兩指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Livin及Caspase-3蛋白在卵巢癌組及對照組中的表達(dá)卵巢癌組Livin蛋白表達(dá)率為81.58%，對照組33.33%，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Caspase-3在卵巢癌組及對照組表達(dá)的陽性率分別為47.37%和83.33%，兩者之間差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.2 卵巢癌中Livin蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Livin蛋白在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)，且腫瘤分化程度越低，Livin蛋白表達(dá)越強(qiáng)(P＜0.05)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05);但與卵巢癌的組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，見表1。

表1 Livin蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 卵巢癌組織中Livin與Caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 在62例Livin蛋白表達(dá)陽性的卵巢癌組織中，Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率為41.94%(26/62);在14例Livin蛋白陰性表達(dá)組中，Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率為71.43%(10/14)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明二者為負(fù)相關(guān)(χ2=3.981，P＜0.05，r=-0.223)。

3 討論

多細(xì)胞生物體細(xì)胞數(shù)量恒定取決于細(xì)胞增殖與凋亡間的動(dòng)態(tài)平衡，破壞平衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在惡性腫瘤病變中，細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)增加，但增殖速率明顯大于凋亡速率。當(dāng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/(或)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，則會影響腫瘤的生長。Livin基因是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，具有強(qiáng)大的凋亡抑制功能，其異常表達(dá)與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3]，成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

Livin是IAP家族中新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡蛋白，Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4.6kb，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。Livin抗凋亡活性就主要依賴于其BIR結(jié)構(gòu)域。Livin在正常成人的大多數(shù)組織中(除胎盤)均不表達(dá)，表皮、淋巴、脾臟和黑色素細(xì)胞表達(dá)很低。在胎兒發(fā)育過程中多種組織高表達(dá)，如胎兒的腦、胸腺、腎和肝。Livin可能需要通過一系列的凋亡刺激物的作用來表現(xiàn)凋亡的抑制，其抑制凋亡的信號通路包括:外在途徑即細(xì)胞表面的死亡受體，內(nèi)在途徑即細(xì)胞色素C依賴途徑和化療藥物途徑;細(xì)胞在接受到足夠的凋亡刺激信號后，Caspase-3、-7、-9的酶水解作用被激活而執(zhí)行凋亡功能[4]。另有研究報(bào)道，Livin的RING指結(jié)構(gòu)可引起Caspase蛋白的降解，發(fā)揮其抗凋亡作用。

大量研究表明，Livin的分布具有腫瘤組織特異性，在一些癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)，如淋巴瘤、HaCat細(xì)胞、MCF7乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌、白血病以及宮頸癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等，尤其在黑色素瘤細(xì)胞系C361和SK-Me129中表達(dá)水平最高[5]。本研究用免疫組化SP法檢測Livin蛋白在24例良性卵巢上皮性腫瘤、76例卵巢癌組織中，陽性表達(dá)率分別是33.33%和81.58%，卵巢癌組織中Livin蛋白表達(dá)明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤，表明Livin和卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。提示Livin表達(dá)發(fā)生在卵巢癌惡性轉(zhuǎn)化的早期，表明Livin與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。Livin在卵巢癌組織中的表達(dá)可能抑制了異常突變的細(xì)胞的凋亡，從而擾亂了細(xì)胞生長和凋亡途徑，促使細(xì)胞逃離生長監(jiān)控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

國外許多研究表明，凋亡抑制因子Livin與多種腫瘤的預(yù)后及患者的存活時(shí)間密切相關(guān)，其表達(dá)程度與病程進(jìn)展和不良的組織學(xué)相一致[6]。研究發(fā)現(xiàn)低分化卵巢癌中細(xì)胞凋亡明顯低于中、高分化卵巢癌，且存在多種調(diào)節(jié)因子的紊亂，認(rèn)為凋亡及其調(diào)節(jié)因子的紊亂與卵巢癌的惡性行為有關(guān)，并影響預(yù)后。本研究中卵巢癌組織分化程度越低，其Livin蛋白表達(dá)越強(qiáng)，而Ⅲ、IV期卵巢癌組織中Livin表達(dá)顯著增高則進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。Livin通過抑制腫瘤組織中正常細(xì)胞凋亡的作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而增加了癌細(xì)胞的侵襲能力，其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)越高，對凋亡的抑制能力就越強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的存活能力和惡性程度就越高，就更易侵襲周圍組織而發(fā)生轉(zhuǎn)移。

Caspase蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行凋亡過程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)分子，它可以單獨(dú)或協(xié)同參與水解許多與凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)。Caspase-3活化主要有兩條途徑:一是經(jīng)細(xì)胞表面膜受體如Fas、TNFR1等活化;另一條途徑是死亡刺激因子作用下線粒體釋放細(xì)胞色素C?；罨腃aspase-3執(zhí)行效應(yīng)Caspase的作用，非選擇性分裂水解其他蛋白、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶以及本身，激活DNA片斷因子，導(dǎo)致DNA降解、核漿碎裂、細(xì)胞凋亡[2]。本研究顯示Caspase-3蛋白在24例良性卵巢上皮性腫瘤、76例卵巢癌組織中，陽性表達(dá)率分別是83.33%和47.37%，卵巢癌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于良性卵巢上皮性腫瘤組織，提示Caspase-3和卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)Livin與Caspases結(jié)合有高度的親和性和特異性，這依賴于BIR結(jié)構(gòu)域的完整。BIR是一種新型的鋅指結(jié)構(gòu)，而Livin中BIR結(jié)構(gòu)是抗凋亡活性所必需。如BIR結(jié)構(gòu)域單個(gè)氨基酸發(fā)生突變可導(dǎo)致 Livin與Caspases親和力下降，使Livin的抗凋亡能力明顯減低甚至消失[7]。另有研究報(bào)道，Livin的RING指結(jié)構(gòu)可引起Caspases蛋白的降解，發(fā)揮其抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中Livin與Caspase-3蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。提示在卵巢癌的演變過程中Livin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，阻斷細(xì)胞的凋亡過程，從而促進(jìn)了卵巢癌的癌細(xì)胞不斷增殖。

Livin與Caspases的異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Livin在卵巢癌中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期密切相關(guān)，可能是影響卵巢癌預(yù)后的重要分子指標(biāo)，有關(guān)Livin與Caspases對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]Nachmias B，Mizrahi S，Elmalech M，et al.Manipulation of NK cytotoxicity by the IAP family member Livin.Eur J Immunol，2007，37(12):3467-3476.

[2]Lu S，Zhang B，Wang Z.Expression of survivin，cyclin D1，P21(WAF1)，caspase-3 in cervical cancer and its relation with prognosis.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2005，25(1):78-81.

[3]Liu P，Wang TS，You SH，et al.Expression of livin in gastric dancer and effect of silencing of the livin gene on apoptosis in gastric cancer cells.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2007，29(8):570-574.

[4]Li JH，He WJ，He YJ.Expression and clinical significance of Survivin and Livin in Dukeso B colorectal cancer.Ai Zheng.2007，26(5):547-551.

[5]焦伊勝，王永來，張淑蘭，等.Livin、Smac在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(02):0296-0299.

[6]Crnkovi Mertens I，Semzow J，et al.Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells.J Mol Med，2006，84(3):232-240.

[7]朱紅玲，周家德.Survivin和Caspase-3在卵巢上皮性癌中的表達(dá).中國婦幼保健，2008，23(13):1860-1864.