孫 亨 綜述 王艷霞 吳 江 審校

1（四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都610041）

2（四川大學(xué) 圖書(shū)館，成都610041）

1 介紹

在醫(yī)學(xué)研究中，尋找可替代的生物材料一直是一個(gè)熱門(mén)話題。尤其對(duì)于移植的組織來(lái)源，若是使用自體的組織，則組織的量和可取的部位都十分有限；若是來(lái)源于異體組織，則免疫反應(yīng)可能會(huì)造成十分嚴(yán)重的后果。因此，尋找不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的異體組織來(lái)源，成為研究的一個(gè)方向。經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞的組織，能夠很大幅度降低免疫反應(yīng)，是作為組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想材料。

脫細(xì)胞的方法很多，也會(huì)根據(jù)組織和器官的不同而改變。根據(jù)脫細(xì)胞方法性質(zhì)的不同，可以大體上將其分為物理、化學(xué)和酶學(xué)方法，每種方法對(duì)組織的作用不同，清除細(xì)胞的成分和效率不同，對(duì)剩下的細(xì)胞外基質(zhì)支架的影響也不同。這些差異反過(guò)來(lái)也會(huì)影響移植后宿主對(duì)生物材料的反應(yīng)。

2 脫細(xì)胞的基本原理

從組織中脫細(xì)胞可以分離出由結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白組成的復(fù)雜混合物，即細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellu－lar Matrix，ECM）。異種和同種異體的細(xì)胞抗原會(huì)被宿主識(shí)別為異物，因此會(huì)使組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫排斥。但ECM卻不會(huì)產(chǎn)生以上反應(yīng)，即使是異種來(lái)源，它也能被宿主很好地接受。脫細(xì)胞的目的就是要有效地去除組織中所有的細(xì)胞成分，同時(shí)使其對(duì)ECM化學(xué)組成、生物活性和機(jī)械特性的副作用最小化。

組織脫細(xì)胞最常用的方法是物理化學(xué)結(jié)合的方法。物理方法包括機(jī)械攪拌、凍融法、加壓、超聲處理等。這些方法會(huì)直接破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋出。但僅僅使用物理方法還不能達(dá)到脫細(xì)胞的目的，還需要借助化學(xué)方法來(lái)清除被破壞的細(xì)胞成分。比如使用各種洗滌劑，抑或是酶處理來(lái)溶解細(xì)胞碎片。也可以直接使用化學(xué)或酶學(xué)方法來(lái)進(jìn)行脫細(xì)胞［2，6］，不過(guò)各種洗滌劑和酶作用的成分都有差異，往往需要多種試劑合用來(lái)達(dá)到脫細(xì)胞的目的，脫細(xì)胞過(guò)程的處理時(shí)間也較長(zhǎng)［4］。有的ECM在處理過(guò)程中必須被破壞，這樣才能使細(xì)胞充分暴露于洗滌劑中，從而使細(xì)胞能更有效率地被清除。特別是較厚的組織，深處的細(xì)胞往往不能與洗滌劑充分接觸，因而脫細(xì)胞的效果不甚理想。大多數(shù)脫細(xì)胞處理都想盡可能減少對(duì)ECM的破壞，從而保持ECM原有的機(jī)械特性和生物特性。

3 脫細(xì)胞方法

最常用、最有效的脫細(xì)胞方法可以分為物理、化學(xué)和酶學(xué)方法。通常先使組織細(xì)胞的細(xì)胞膜溶解，再將細(xì)胞成分和ECM分離，溶解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，最終清除組織中的細(xì)胞碎片。第一步可以使用物理、化學(xué)和酶學(xué)方法完成，而后面幾步通常使用化學(xué)和酶學(xué)方法完成。在處理的過(guò)程中，可以與機(jī)械攪拌配合來(lái)增強(qiáng)化學(xué)和酶學(xué)試劑的作用。在脫細(xì)胞之后，所有殘留的試劑都必須被清除，以防止這些化學(xué)物質(zhì)與宿主起反應(yīng)。脫細(xì)胞和保留ECM的效果可以用多種方法進(jìn)行評(píng)估［7，8］。下面將對(duì)各種組織脫細(xì)胞方法進(jìn)行回顧。

3.1 物理方法

可以用來(lái)進(jìn)行脫細(xì)胞處理的物理方法有冷凍、超聲處理、加壓、攪拌和射線等。

3.1.1 速凍和凍融法 速凍法已經(jīng)在與肌腱和韌帶［10］有關(guān)的組織和神經(jīng)組織［11］的脫細(xì)胞中使用。近來(lái)也有人在其他組織上使用，如血管［45］和擬胚體［9］。通過(guò)反復(fù)凍融的方法，能提高脫細(xì)胞的作用［9，45］?？焖倮鋬鼋M織后，細(xì)胞內(nèi)冰結(jié)晶形成，破壞細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶解。為了避免冰結(jié)晶對(duì)ECM造成破壞，溫度變化的速率必須受到精確的調(diào)控。在破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，還需要洗滌劑將細(xì)胞碎片等清除。

3.1.2 加壓法 采用對(duì)組織直接加壓的辦法能讓細(xì)胞被直接破壞，但這種方法僅對(duì)ECM非緊密排列的組織或器官有效（比如肝、肺）［1］。最近，F(xiàn)unamoto等使用超高壓（高靜水力學(xué)加壓法High－h(huán)ydrostatic pressurization，H HP或超高壓靜水力學(xué)加壓法Ultrahigh hydrostatic pressurization，UHP）的方法對(duì)血管、角膜等進(jìn)行脫細(xì)胞，取得了很好的效果［3－5，12］。在一定的溫度下，將組織浸于含葡聚糖的磷酸緩沖液PBS中，逐步加壓至約980 MPa，持續(xù)約10分鐘。完成后，再使用洗滌劑脫去殘留的細(xì)胞成分。這種方法簡(jiǎn)便快速，脫細(xì)胞的效率也很高，但高壓對(duì)ECM的影響還沒(méi)有完全研究清楚。已經(jīng)有研究證明了高壓對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用［13，14］，但其對(duì)膠原的具體作用研究還十分有限。另外，由于壓力變化會(huì)改變水的溶點(diǎn)，高壓使水溶點(diǎn)上升，因此在進(jìn)行加壓處理的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生冰結(jié)晶從而對(duì)ECM造成破壞。所以在處理的過(guò)程中需要對(duì)溫度和壓力上升速率等進(jìn)行控制。已經(jīng)有報(bào)道證明H HP能破壞細(xì)菌、真菌和有包膜病毒的磷脂雙分子層，這說(shuō)明H HP處理具有滅菌的作用。當(dāng)壓力大于600 MPa時(shí)，就可以讓細(xì)菌和有包膜病毒失活［15］，因此980 MPa的高壓已經(jīng)足夠保證其滅菌效果。

另一種基于加壓的物理脫細(xì)胞方法是對(duì)流脫細(xì)胞法（Convective flow decellularization）。對(duì)于血管等組織，通過(guò)對(duì)流加強(qiáng)管壁壓力來(lái)達(dá)到脫細(xì)胞的目的。這種方法能有效去除可溶性蛋白，甚至包括難以檢測(cè)到的蛋白。不過(guò)，過(guò)高的壓力反而可能降低脫細(xì)胞的效果，這可能是因?yàn)槌掷m(xù)高壓使管壁ECM更加緊密，減少了孔隙，無(wú)法直接脫去細(xì)胞［7］。

3.1.3 放射法 通過(guò)射線可以破壞細(xì)胞，降低其抗原性。可以將射線和其他化學(xué)洗滌劑一起使用［16］，也可以用來(lái)對(duì)特殊組織進(jìn)行處理，比如神經(jīng)細(xì)胞。X射線可以殺死施萬(wàn)細(xì)胞（Schwann cell），破壞其分泌抗生素原物質(zhì)的功能，又能通過(guò)保留的神經(jīng)膜管結(jié)構(gòu)支架使周?chē)窠?jīng)得以再生。大劑量的放射線照射能降低異體神經(jīng)細(xì)胞的免疫原性，但是否會(huì)損壞組織形態(tài)尚有爭(zhēng)議［46］。

3.1.4 機(jī)械攪拌和超聲處理 機(jī)械攪拌和超聲處理與化學(xué)方法同時(shí)使用可以用來(lái)幫助細(xì)胞的溶解和細(xì)胞碎片的清除。現(xiàn)在還沒(méi)有研究來(lái)確定使用超聲破壞細(xì)胞的最佳頻率，不過(guò)一臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)的超聲清潔機(jī)已能夠有效清除定軌搖床上放置的組織中的細(xì)胞成分［1］。

3.2 化學(xué)方法

3.2.1 酸堿處理 酸堿可以使細(xì)胞質(zhì)成分溶解和破壞核酸，比如乙酸、過(guò)氧乙酸（Peracetic acid，PAA）、透明質(zhì)酸、硫酸和氨水等，可以有效破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器［17，18］。但是這些化學(xué)物質(zhì)也能破壞許多其他分子如糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG），后者是ECM的重要成分之一。

許多豬的組織，包括小腸粘膜下層（Small intestinal submucosa，SIS）和膀胱粘膜下層（Urinary Bladder Submucosa，UBS），已經(jīng)使用0.10～0.15%（w／v）的PAA成功脫細(xì)胞。在經(jīng)過(guò)PAA處理后，ECM中仍然含有許多原有的GAG包括透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素A和硫酸皮質(zhì)素等［19］，還有層粘連蛋白和纖維連接蛋白［20］。不僅如此，在處理后還保留了很多駐留在ECM中的生長(zhǎng)因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factorβ，TGF－β），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，BFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）［21，22］。而在生物支架的機(jī)械特性上，PAA處理沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何副作用［18］。

3.2.2 非離子洗滌劑 非離子洗滌劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種脫細(xì)胞方案中，因?yàn)樗鼈儗?duì)組織結(jié)構(gòu)的反應(yīng)相對(duì)比較溫和，脫細(xì)胞效率也較高。非離子洗滌劑破壞脂質(zhì)之間和脂－蛋白之間的相互作用，卻不破壞蛋白之間的相互作用，所以組織經(jīng)非離子洗滌劑處理后，其中的蛋白仍能具有功能構(gòu)象［23］。

曲拉通（Triton）X－100是脫細(xì)胞方案中研究最廣泛的非離子洗滌劑。使用Triton X－100脫細(xì)胞的結(jié)果會(huì)根據(jù)組織的不同而不同。當(dāng)Triton X－100用于心臟瓣膜的脫細(xì)胞時(shí)，經(jīng)過(guò)24小時(shí)的處理，可以使核物質(zhì)完全被清除而保持瓣膜結(jié)構(gòu)；但是對(duì)于旁邊的心肌和主動(dòng)脈壁，它卻不能很好地清除細(xì)胞［24］。對(duì)于瓣膜的ECM，Triton X－100導(dǎo)致幾乎所有GAG丟失，也減少了層粘連蛋白和纖維連接蛋白含量［24］；不過(guò)在前十字韌帶（Anterior cruciate ligament，ACL）的脫細(xì)胞中，被Triton X－100處理4天的硫化GAG卻沒(méi)有變化［25］。Triton X－100對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁的清除作用較好，而對(duì)細(xì)胞核的清除能力較差［2］。Triton對(duì)于細(xì)胞還有較強(qiáng)的毒性作用，因此在脫細(xì)胞后也要盡量清除組織支架上殘留的Triton。在脫細(xì)胞過(guò)程中，Triton X－100常與其它洗滌劑搭配使用［6，52］，如與十二烷基 硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）搭配，往往可以起到很好的效果［2，26］。

3.2.3 離子洗滌劑 離子洗滌劑對(duì)溶解細(xì)胞質(zhì)和核都很有效，但它也能通過(guò)破壞蛋白之間的鍵而使蛋白質(zhì)變性。最常用的離子洗滌劑是十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、脫氧膽酸鈉（Sodium deoxycholate，SD）和 Triton X－200［6，25－29］。

SDS對(duì)脫去組織中的細(xì)胞成分非常有效，能將殘留的細(xì)胞核成分和蛋白清除得更徹底［25］。但SDS對(duì)ECM的破壞也更強(qiáng)，會(huì)使GAG密度下降，破壞膠原的完整結(jié)構(gòu)。不過(guò)SDS不會(huì)清除組織中的膠原。由于SDS對(duì)核清除能力較強(qiáng)，常與清除細(xì)胞質(zhì)能力較強(qiáng)的 Triton X－100合用［2，26］。

SD對(duì)清除殘留的細(xì)胞成分也非常有效，但與SDS相比，它對(duì)組織本身結(jié)構(gòu)的破壞更大。目前還沒(méi)有單獨(dú)使用SD進(jìn)行組織脫細(xì)胞的報(bào)道，因此很難估計(jì)它單獨(dú)對(duì)ECM的作用。SD也可以與其他兩性離子洗滌劑一起對(duì)神經(jīng)組織進(jìn)行脫細(xì)胞，但效果并不如Triton X－200和兩性離子洗滌劑一起作用好，后者對(duì)神經(jīng)組織的脫細(xì)胞能取得較理想的效果［28，29］。

3.2.4 兩性離子洗滌劑 兩性離子洗滌劑表現(xiàn)出非離子和離子洗滌劑的雙重特性。兩性離子洗滌劑更容易使蛋白質(zhì)變性。常用的有3－［（3－膽固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸（3－［（3－cholamidopropyl）dimethylammonio］－1－propanesulfonate， CHAPS）（用于血管脫細(xì)胞）［30］、硫代甜菜堿－10（Sulfobetaine－10，SB－10）和－16（SB－16）（用于神經(jīng)脫細(xì)胞）［28，29］。經(jīng)CHAPS處理的動(dòng)脈，具有組織學(xué)意義上的正常膠原，其彈力蛋白形態(tài)和膠原成分都與原動(dòng)脈相似。雖然經(jīng)CHAPS處理后的血管爆破壓和最大應(yīng)力都會(huì)有顯著下降，不過(guò)這和使用Triton X－100與低／高滲溶液處理后的結(jié)果相似［30］。對(duì)于神經(jīng)組織的脫細(xì)胞，外周神經(jīng)已經(jīng)成功用SB－10，SB－16和 Triton X－200進(jìn)行了脫細(xì)胞，其效果比Triton X－100與SD結(jié)合處理的效果更好，對(duì)ECM的影響更少［28，29］。

3.2.5 磷酸三丁酯 磷酸三丁酯（Tri（n－butyl）phosphate，TBP）是一種有機(jī)溶劑，近幾年開(kāi)始用于脫細(xì)胞。用TBP可以完全清除鼠尾韌帶中的細(xì)胞核成分，不過(guò)在韌帶與骨的連接處細(xì)胞成分清除不是很完全。與對(duì)照組相比，TBP處理對(duì)從鼠尾分離的膠原纖維的抗張強(qiáng)度沒(méi)有影響。但是對(duì)于ACL，TBP的處理會(huì)導(dǎo)致膠原成分減少［25，31］。TBP是一種很有前途的脫細(xì)胞試劑，它在脫細(xì)胞的過(guò)程中對(duì)ECM的機(jī)械性質(zhì)影響最小［1］。

3.2.6 聚乙二醇 聚乙二醇（poly（ethylene glycol），PEG）是一種生物相容的兩性聚合物（biocompatible amphiphilic polymer），可以用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞融合，也能用于脫細(xì)胞處理。PEG能使分子間疏水部分的相互作用加強(qiáng)［36］，從而能破壞細(xì)胞膜上的蛋白、脂質(zhì)等，引起細(xì)胞膜的改變。細(xì)胞膜的改變又引起細(xì)胞通透性和滲透壓等一系列變化，最終細(xì)胞被破壞清除。但是，聚乙二醇單獨(dú)無(wú)法完全清除細(xì)胞和細(xì)胞核，需要和其他試劑同時(shí)使用［44］。在脫細(xì)胞過(guò)程中，輔以物理方法（比如機(jī)械攪拌或用玻璃棒輕輕擠壓組織［35］）可以獲得更好的效果。與曲拉通等洗滌劑方法或胰蛋白酶方法相比，PEG為血管脫細(xì)胞的效果更好［35，53］，并且PEG不是洗滌劑，對(duì)細(xì)胞毒性更小，不需要進(jìn)行大量沖洗，移植應(yīng)用也更安全。

3.2.7 低滲和高滲溶液 低滲和高滲溶液可以通過(guò)滲透壓的變化溶解組織中的細(xì)胞。例如，通過(guò)低滲溶液（10m M Trizma HCl，5m M EDTA）處理11小時(shí)后，再用高滲溶液（50m M Trizma HCl，1M NaCl，10m M EDTA）處理11小時(shí)，就能引起細(xì)胞的溶解［30］。之后再用化學(xué)或酶處理來(lái)幫助清除細(xì)胞碎片。

3.2.8 螯合劑 螯合劑，比如乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）和乙二醇雙四乙酸（ethylene glycol bis（2－aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA），可以形成一種印戒狀的分子復(fù)合物，用于結(jié)合位于其中心的金屬離子，并將其與細(xì)胞分離。一些二價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2＋和Mg2＋）對(duì)細(xì)胞的粘附非常必要，這些試劑通過(guò)結(jié)合在細(xì)胞與ECM粘附中出現(xiàn)的二價(jià)陽(yáng)離子，來(lái)促使細(xì)胞與ECM分離。EDTA 往往和胰蛋白酶結(jié)合使用［53，39］。

3.2.9 交聯(lián)劑 在脫細(xì)胞過(guò)程中，由于細(xì)胞丟失和ECM的破壞等，會(huì)使支架的機(jī)械特性改變。因此可以使用交聯(lián)劑（如化學(xué)交聯(lián)劑乙二醇縮水甘油醚EX－810［42］或天然的生物交聯(lián)劑京尼平（Genipin）［43］等）交聯(lián)支架，在抵抗脫細(xì)胞過(guò)程破壞的同時(shí)，也能起到促進(jìn)脫細(xì)胞和封閉抗原的作用。也有實(shí)驗(yàn)直接使用交聯(lián)劑EX－810配合蒸餾水和超聲處理進(jìn)行脫細(xì)胞，取得成功［42］，說(shuō)明交聯(lián)劑也能作為脫細(xì)胞的一種試劑使用。

3.3 酶學(xué)方法

脫細(xì)胞的酶處理技術(shù)包括蛋白酶消化、核酶消化和鈣螯合物試劑的使用等。

3.3.1 胰蛋白酶 胰蛋白酶是脫細(xì)胞方案中最常用的蛋白水解酶之一。胰蛋白酶是一種高特異性的酶，能特異性打斷精氨酸和賴氨酸C端的多肽鍵（如果它們連接的不是脯氨酸）。其最適溫度為37攝氏度，最適p H為8.0。胰酶極易被血清中和，不必進(jìn)行大量的沖洗，易于使用，生物相容性高。不過(guò)胰酶雖然常用，但它的脫細(xì)胞效果并不十分出色，特別對(duì)于較厚的組織，胰酶很難完全清除深部的細(xì)胞成分［39，40，53］。

有些研究表明，使用0.05%胰蛋白酶／0.02%EDTA和攪拌處理豬肺瓣膜24小時(shí)，其脫細(xì)胞作用很有效［32］；而另一些研究表明，使用0.5%胰蛋白酶，0.05%EDTA，0.02%慶大霉素，0.02 mg／ml脫氧核苷酸酶（DNase）和20μg／ml核苷酸酶A（RNase A），在超純凈水中以37攝氏度攪拌17小時(shí)能使細(xì)胞失活，但卻無(wú)法從組織中清除細(xì)胞成分［24］。

胰蛋白酶對(duì)組織的影響也有副作用。胰酶對(duì)ECM會(huì)有不同程度的破壞，其程度隨著時(shí)間的推移而增加，甚至?xí)斐蓢?yán)重的影響［6，32，41］。不過(guò)胰酶不會(huì)影響組織中的膠原數(shù)量。延長(zhǎng)組織在胰蛋白酶／EDTA中的時(shí)間會(huì)極大減少?gòu)椓Φ鞍缀虶AG含量，甚至?xí)p少組織的抗張強(qiáng)度達(dá)50%［1］。因此要減少胰蛋白酶對(duì)ECM的影響，就要盡量減少胰蛋白酶的作用時(shí)間。

3.3.2 核酶 核酶分為內(nèi)切酶和外切酶。內(nèi)切酶催化核苷酸或脫氧核苷酸內(nèi)部鍵的水解，而外切酶催化核苷酸或脫氧核苷酸末端的鍵水解，它們最終都導(dǎo)致DNA或RNA的降解。

3.3.3 磷酸酯酶A2 磷酸酯酶A2（Phospholipase A2，PLA2）是一種特異性的酯酶，用于水解細(xì)胞的磷脂成分，因此可以用來(lái)在脫細(xì)胞過(guò)程中溶解細(xì)胞。PLA2可以在sn－2處打斷細(xì)胞膜上甘油磷脂的酯鍵，使其變?yōu)橛坞x脂肪酸和溶血磷酸。PLA2催化水解需要Ca2＋，胰PLA2適應(yīng)的p H 范圍為7－9［33］。PLA2單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞核的清除能力較弱，且長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)GAG的破壞作用較大，因此可與其他洗滌劑如SD配合，能顯著縮短脫細(xì)胞時(shí)間，提高脫細(xì)胞效果［34］。

3.4 蛋白酶抑制劑

在脫細(xì)胞過(guò)程中，很多蛋白酶會(huì)從被破壞的細(xì)胞中釋放。在長(zhǎng)時(shí)間的化學(xué)處理過(guò)程中，這些酶可以損傷ECM的超微結(jié)構(gòu)。因此，有必要在浸潤(rùn)組織的溶液中加入蛋白酶抑制劑（使用胰蛋白酶等脫細(xì)胞除外）如苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF）、抑肽酶、亮肽素等。p H7－8的緩沖溶液能抑制許多蛋白酶，控制脫細(xì)胞的時(shí)間也能限制蛋白酶對(duì)組織的影響［1］。

3.5 抗生素

為了避免在脫細(xì)胞過(guò)程中造成微生物污染，應(yīng)該向溶液中加入抗生素比如青霉素、鏈霉素等。但要注意清洗支架時(shí)將這些抗生素清洗干凈，以免對(duì)宿主造成影響。

4 殘留化學(xué)物質(zhì)的清除

用化學(xué)或酶學(xué)方法脫細(xì)胞后，由于所使用的試劑對(duì)組織都有一定程度的損傷作用，并且可能在移植后對(duì)宿主造成影響，如對(duì)細(xì)胞的毒性作用或誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生超敏反應(yīng)等。因此有必要在脫細(xì)胞處理完成后清除殘留在組織支架上的化學(xué)物質(zhì)或酶。

5 組織多樣性和不同脫細(xì)胞方案的影響

前文已經(jīng)述及，同樣的脫細(xì)胞方案對(duì)不同的組織效果不同，有可能在一種組織上很有效的脫細(xì)胞方法，在另一種組織中卻完全沒(méi)有效果［24，32］。而對(duì)于相同的試劑，不同的作用時(shí)間、順序和方法，也可能造成不同的結(jié)果［32］。甚至可能在脫細(xì)胞方案中的微小差別也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此對(duì)于我們研究的每一種組織，都有必要完善我們的脫細(xì)胞方案來(lái)獲得更好的結(jié)果。

由于脫細(xì)胞試劑或方法往往是針對(duì)細(xì)胞的某一個(gè)部位來(lái)破壞或清除細(xì)胞，因此單一的試劑或物理方法不能達(dá)到理想的脫細(xì)胞結(jié)果。我們需要根據(jù)脫細(xì)胞試劑或物理方法本身的特點(diǎn)，進(jìn)行合理的搭配與互補(bǔ)，才能獲得較好的脫細(xì)胞效果。比如Triton X－100（對(duì)細(xì)胞質(zhì)清除較好）與SDS（對(duì)細(xì)胞核清除較好）相配合。又如涂秋芬等以超聲處理與交聯(lián)劑配合［42］，在脫細(xì)胞的同時(shí)盡量保證支架的完整性與三維結(jié)構(gòu)，以利于移植后的細(xì)胞再生。

對(duì)于血管、瓣膜、軟骨等軟組織來(lái)說(shuō)，使用Triton X－100配合SDS是比較成熟的辦法。此方法已經(jīng)被很多人所使用，在處理時(shí)間恰當(dāng)?shù)那闆r下，能有效去除細(xì)胞成分而不對(duì)ECM造成明顯的影響。對(duì)于骨組織，由于其機(jī)械強(qiáng)度也是很重要的一個(gè)方面，所以需要重點(diǎn)注意脫細(xì)胞過(guò)程中對(duì)膠原纖維的破壞程度和對(duì)膠原纖維之間的連接及其三維結(jié)構(gòu)的影響。在20世紀(jì)50年代Martz等就使用H2O2浸泡等方法制作出了被稱為 Kiel骨的脫細(xì)胞骨［37，38］，并在隨后的幾十年中獲得了廣泛的臨床應(yīng)用［47］。在此基礎(chǔ)上，使用H2O2——乙醚的方法制作脫細(xì)胞骨，在機(jī)械性能和免疫反應(yīng)兩方面都取得了較好的效果［49，50，51］。對(duì)于神經(jīng)組織，雖然很多物理方法如凍融和放射等對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有較好的效果，但如前所述，其對(duì)神經(jīng)纖維的破壞和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的再生效果還存在爭(zhēng)議［46，48］。有報(bào)道指出，使用 Triton X－200和 SB－10或SB－16能取得比Triton X－100和SD更好的脫細(xì)胞效果［28，29，46］。

6 總結(jié)

絕大多數(shù)脫細(xì)胞方案都需要多種方法或試劑相結(jié)合使用，根據(jù)組織的不同制定不同的方案，在盡量保存ECM完整性的情況下盡可能多地脫去組織中的細(xì)胞成分。一種可能的思路是通過(guò)不同脫細(xì)胞方法的優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)來(lái)提高脫細(xì)胞的效率。在脫細(xì)胞時(shí)，要盡量縮短處理時(shí)間，通過(guò)循序漸進(jìn)的方式，找到最合適的時(shí)間點(diǎn)，以期達(dá)到理想的脫細(xì)胞效果。目前看來(lái)，幾乎所有的脫細(xì)胞方法都會(huì)對(duì)細(xì)胞支架產(chǎn)生影響，但影響的強(qiáng)弱和方面有所不同：有的會(huì)使ECM成分丟失，有的會(huì)改變ECM超微結(jié)構(gòu)從而使其機(jī)械特性受到影響。我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)際需求選擇脫細(xì)胞的方式，使其對(duì)我們需要用到的性能影響最小。需要注意的是，有些處理過(guò)程雖然不會(huì)對(duì)ECM造成直接的影響，但有可能影響支架在植入受體后的變化，比如更容易被體內(nèi)的酶降解。

迄今為止，還沒(méi)有能100%去除組織內(nèi)細(xì)胞成分的方法。但從現(xiàn)在的應(yīng)用來(lái)看，目前的脫細(xì)胞水平已經(jīng)能滿足移植所需要的安全性。已經(jīng)有多種脫細(xì)胞組織進(jìn)入了臨床，比如人類(lèi)真皮（Alloderm?，Life－Cell，Corp.），豬小腸結(jié)膜（SurgiSIS?，Cook Biotech，Inc.；Restore?，DePuy Orthopaedics，Inc.），豬膀胱 （ACell，Inc.），豬心臟瓣膜 （Synergraft?，Cryo Life，Inc.）［1］。這也表示組織脫細(xì)胞技術(shù)具有重要的意義和廣闊的前景。

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