林海鳴 吳銀生 林燕萍△

1(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州350003)

2(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福州350003)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是威脅中老年人健康的一種常見的疾病,國內(nèi)外對骨質(zhì)疏松癥的研究都非常重視,由于西藥在治療OP方面有毒副作用較大、遠(yuǎn)期療效不肯定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),因此中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的研究日益受到重視[1]。骨質(zhì)疏松由骨代謝失衡引起,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都是骨代謝過程中的重要核心細(xì)胞,成骨細(xì)胞不僅參與骨形成,而且還參與破骨細(xì)胞性骨吸收的調(diào)節(jié),因此對成骨細(xì)胞的研究成了骨質(zhì)疏松癥防治的一個(gè)研究熱點(diǎn),近年來不少學(xué)者從細(xì)胞分子生物學(xué)角度開展了中醫(yī)藥對成骨細(xì)胞(OB)影響的實(shí)驗(yàn)研究,為中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松提供了分子生物學(xué)理論依據(jù),其中運(yùn)用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)和中藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn),研究骨質(zhì)疏松的中藥防治是常用的方法之一,以下就有關(guān)研究綜述如下:

1 中藥血清藥理學(xué)

中藥成分復(fù)雜,除有效成分外,還含有非有效成分和雜質(zhì),甚至毒性成分等。若將中藥粗制品直接加入離體生物反應(yīng)體系,可能導(dǎo)出假陽性或假陰性或相反的結(jié)果。為解決這一問題,學(xué)者們提出了中藥血清藥理學(xué)。

中藥血清藥理學(xué)(含藥血清)是指給動物灌胃或人服用一定量的中藥單方或復(fù)方制劑,一定時(shí)間采血,分離血清,用含中藥成分血清進(jìn)行體外試驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法[2]。血清藥理學(xué)方法首先由日本田代真一于1984年提出[3]。我國1995年起開始有關(guān)中藥血清藥理學(xué)研究的報(bào)道[4,5]。該法排除了在體外實(shí)驗(yàn)過程中藥物與細(xì)胞直接作用時(shí)某些因素的干擾,客觀地模擬了藥物與機(jī)體相互作用過程,較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生的藥理效應(yīng)的真實(shí)過程,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度提高,是一種較為科學(xué)的中藥藥理學(xué)研究方法[6]。

然而,血液包括血細(xì)胞與血漿兩個(gè)部分,血清是血液凝固后除去纖維蛋白與血細(xì)胞的液體部分,它有別于血漿。而且,含藥血清制備時(shí)未經(jīng)抗凝處理,凝血及其繼發(fā)的一系列生物學(xué)反應(yīng)不僅明顯改變了血液成分,而且對中藥成分與其派生物質(zhì)可能產(chǎn)生影響。因此,采用血清藥理學(xué)方法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一定都是可靠的,其中可能存在假陽性和假陰性問題[7]。由于血清與血漿存在多種多樣的差異,所以,為反映體內(nèi)的實(shí)際情況,越來越多學(xué)者主張?jiān)卺t(yī)學(xué)研究與臨床檢驗(yàn)中,特別是蛋白組學(xué)、肽組學(xué)與代謝組學(xué)研究,最好采用血漿,只有在抗凝劑干擾檢驗(yàn)結(jié)果的情況下,才考慮采用血清[8,9,10]。并指出中藥成分十分復(fù)雜,在實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)當(dāng)采用含藥血漿與含藥血清藥理學(xué)方法同時(shí)并舉的方法進(jìn)行研究,只有這樣才能排除凝血及其相關(guān)過程與抗凝劑帶來的影響,從而得到令人信服的可靠結(jié)論[7]?，F(xiàn)在在骨質(zhì)疏松癥對成骨細(xì)胞體外試驗(yàn)研究中,大都采用中藥血清,如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法,提高結(jié)論的確定性有待進(jìn)一步探討。

2 中藥含藥血清對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

中藥含藥血清對成骨細(xì)胞作用的研究包括對成骨細(xì)胞的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制的探討,研究已深入到基因、分子水平。實(shí)驗(yàn)中所用的中藥包括單味中藥和復(fù)方,單味中藥的研究主要有淫羊藿、杜仲、續(xù)斷、當(dāng)歸、自然銅、骨碎補(bǔ)等,對中藥復(fù)方的研究主要包括仙鹿健骨湯、雙龍接骨丸、健骨顆粒、益骨膠囊、強(qiáng)骨寶、健骨二仙丸、骨康、阿膠強(qiáng)骨口服液及其它補(bǔ)腎健脾活血方等。

2.1 中藥含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞增殖的影響

成骨細(xì)胞增殖檢測方法主要有:①胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法;②M TT檢測法;③羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測法。④Brdu檢測法,其中MTT法是檢測細(xì)胞增殖活力的一種簡便、準(zhǔn)確的方法。同時(shí),成骨細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期及其調(diào)控有著密切的關(guān)系,細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程,細(xì)胞在周期時(shí)相的變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)[11]。

既往研究表明,多種中藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用,對增殖的影響與含藥血清濃度、作用時(shí)間點(diǎn)有關(guān),有些藥物的促增殖作用與大鼠的性別有關(guān)。用淫羊藿總黃酮(TFE5種質(zhì)量濃度)及其含藥血清(SRAT)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞(ROB)分別進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),TFE5種質(zhì)量濃度均對ROB細(xì)胞增殖和分化無影響,2%和4%SRAT則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的刺激細(xì)胞增殖活性[12]。通過實(shí)驗(yàn)觀察到補(bǔ)骨脂對新生大鼠成骨細(xì)胞的增殖有顯著促進(jìn)作用,認(rèn)為補(bǔ)骨脂抗骨質(zhì)疏松的作用與其增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖能力有關(guān)[13]。觀察杜仲對成骨樣細(xì)胞 UM R106的增殖的作用實(shí)驗(yàn)中,采用中藥提取物和細(xì)胞共同體外培養(yǎng)的方法,推測杜仲中含有直接刺激成骨樣細(xì)胞增殖的成分,杜仲治療骨質(zhì)疏松癥可能是其中某些化學(xué)成分直接作用于成骨細(xì)胞[14]。M TT法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,老年大鼠含淫羊藿血清對新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用,而淫羊藿總黃酮對由大鼠顱蓋骨分得的成骨樣細(xì)胞沒有明顯作用,但給藥后的大鼠血清則能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖和分化,故推測有效成分是總黃酮的某種代謝產(chǎn)物[15,16]。補(bǔ)腎中藥杜仲含藥血清、大鼠的續(xù)斷含藥血清具有刺激成骨細(xì)胞增殖的作用,這種作用在雌性大鼠的血清中表達(dá)強(qiáng)于雄性大鼠[17]。有研究顯示,藥物劑量高低對成骨細(xì)胞增殖作用有較大的影響,實(shí)驗(yàn)表明高劑量續(xù)斷對成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用,低劑量無明顯影響,中劑量續(xù)斷對細(xì)胞增殖的刺激作用最強(qiáng)[18]。骨疏康含藥血清能不同程度地促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖,其中以20%骨疏康含藥血清促增殖作用最顯著,并且能明顯降低G0/G1期細(xì)胞比例,提高S期成骨細(xì)胞比例及增殖指數(shù),表明骨疏康含藥血清能加速成骨細(xì)胞周期,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[19]。研究還顯示,藥物對不同時(shí)期的成骨細(xì)胞增殖作用也有差異,研究結(jié)果表明單味中藥當(dāng)歸對早期增殖期的成骨細(xì)胞有明顯的促增殖作用[20]。因此,在具體的實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)注意不同的藥物濃度、劑量對不同時(shí)期的成骨細(xì)胞增殖的影響。

2.2 中藥含藥血清對成骨細(xì)胞分化的影響

成骨細(xì)胞是蛋白分泌型細(xì)胞,能產(chǎn)生I型膠原,合成分泌骨基質(zhì),具有高堿性磷酸酶(ALP)活性,并能吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子,是骨形成和骨再建的重要功能細(xì)胞[21]。目前認(rèn)為,ALP活性是成骨細(xì)胞功能及分化程度的指標(biāo),其活性的高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀態(tài),A LP活性越高,表明細(xì)胞越趨成熟,而ALP活性降低,則說明細(xì)胞趨于增殖狀態(tài)。I型膠原蛋白是骨有機(jī)基質(zhì)的主要成份,是成骨細(xì)胞分化的又一特征[22]。礦化是細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟的功能表現(xiàn),促進(jìn)骨礦化的主要細(xì)胞是成骨細(xì)胞。目前在中藥含藥血清對成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究中,ALP活性、骨鈣素含量、Ⅰ型膠原測定及礦化結(jié)節(jié)形成是常用的檢測指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)表明中藥當(dāng)歸對早期增殖期的成骨細(xì)胞有明顯的促分化的作用;當(dāng)歸和自然銅能增加成骨細(xì)胞礦化期礦化結(jié)節(jié)的形成[20]。高、中、低劑量組的阿膠含藥血清對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的增殖無促進(jìn)作用,但對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)ALP的合成有明顯的促進(jìn)作用,提示阿膠含藥血清能促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的分化功能[23]。淫羊藿總黃酮對ROB細(xì)胞分化無影響,而2%和4%淫羊藿總黃酮含藥血清能提高堿性磷酸酶活性、骨鈣素分泌量、礦化結(jié)節(jié)數(shù)和鈣鹽沉積量。提示淫羊藿治療骨質(zhì)疏松的直接物質(zhì)基礎(chǔ)可能并非TFE,而與其經(jīng)給藥后吸收入血的TFE代謝產(chǎn)物及其誘生物有關(guān),血清中的TFE代謝產(chǎn)物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[12]。仙鹿健骨湯含藥血清能促進(jìn)大鼠早期成骨細(xì)胞分化[24],能明顯增加成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成數(shù),促進(jìn)礦化功能,并且提高成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)水平,這可能是該方防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一[25]。淫羊霍甙能促進(jìn)成骨細(xì)胞合成分泌堿性磷酸酶和I型膠原蛋白,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化,使骨形成增加,從而起到健骨作用[26]。糖尿病模型大鼠強(qiáng)骨寶方含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞(OB)的分化及礦化功能有促進(jìn)作用[27]。通過檢測堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量、礦化結(jié)節(jié)形成和I型前膠原mRNA的表達(dá),研究表明健骨二仙丸能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[28]。

成骨細(xì)胞可合成、分泌多種膠原與非膠原蛋白質(zhì)和一些骨代謝調(diào)節(jié)因子。在骨重建中生成類骨質(zhì),修補(bǔ)破骨細(xì)胞骨吸收形成的陷窩,促進(jìn)類骨質(zhì)礦化。因而對骨組織的生長發(fā)育、損傷修復(fù)、骨代謝平衡與骨量維持等起著關(guān)鍵作用。成骨細(xì)胞功能減退導(dǎo)致新骨形成量減少,對骨陷窩的修補(bǔ)能力減弱,造成骨小粱變細(xì)、變薄、穿孔,皮質(zhì)骨出現(xiàn)多孔性改變,引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[29,30]。因此成骨細(xì)胞增殖、分化的研究是防治骨質(zhì)疏松癥的重要課題。

3 研究展望

目前單味中藥及中藥復(fù)方對成骨細(xì)胞增殖分化的影響做了許多研究,由于成骨細(xì)胞的數(shù)量決定了骨形成率,而成骨細(xì)胞的數(shù)量又是由其前體細(xì)胞的增殖和成熟成骨細(xì)胞的生命周期所決定的,因此促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化在防治骨質(zhì)疏松上有重要意義,也是在選擇防治骨質(zhì)疏松中藥時(shí)要檢測的重要指標(biāo)。

既往的研究表明運(yùn)用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)和中藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn),研究骨質(zhì)疏松的中藥防治是可行的方法之一。通過中藥血清藥理學(xué)的運(yùn)用,與傳統(tǒng)的將中藥粗提物直接加入反應(yīng)體系中的方法相比具有明顯的優(yōu)勢:在某種程度上克服了中藥本身的理化性質(zhì)不確定因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,而且更接近藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化的真實(shí)過程,能在一定程度上揭示中藥和復(fù)方在體內(nèi)代謝過程中的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)變,有助于中藥真正有效部位、活性成分的發(fā)現(xiàn)。

面對血清藥理學(xué)的不確定因素,學(xué)者們提出的血漿藥理學(xué)方法值得后續(xù)研究中的關(guān)注,根據(jù)不同的研究,有針對的選擇,或者采用含藥血漿與含藥血清藥理學(xué)方法同時(shí)并行的研究,從而使結(jié)果更可信。

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