劉永新，王桂興，王玉芬，司 飛，孫朝徽，張曉彥，劉海金*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站，山東 秦皇島 066100）

人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育作為細(xì)胞工程育種的一種新技術(shù)，是快速建立純系的有效手段，在魚類染色體操作、遺傳改良以及性別控制等方面都具有潛在的應(yīng)用價值[1]。有絲分裂雌核發(fā)育和減數(shù)分裂雌核發(fā)育是魚類雌核發(fā)育兩種主要形式。有絲分裂雌核發(fā)育是經(jīng)抑制第一次卵裂而形成，其染色體組中一條是以另一條為模板復(fù)制而成，遺傳組成在理論上為純合，亦稱雙單倍體[2－3]。在雄性異配性別決定系統(tǒng)（XX雌性；XY雄性）的魚類品種中，通過靜水壓處理經(jīng)過一代即可獲得完全純合的雙單倍體，但是雙單倍體的成活率非常低。到目前為止，成功誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育獲得雙單倍體的魚類僅有20余種[3]。利用有絲分裂雌核發(fā)育后代開展的研究主要包括兩部分：其一是后代純合性的檢測，只有在全部檢測位點均為純合型的個體才能稱之為雙單倍體，如牙鲆[4－6]、非洲鯰魚[7]、歐鱸[8]、斑點叉尾[9]。其二是以純合的雙單倍體為親本再行誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育制備克隆系，目前已報道的魚類克隆有9個品種：斑馬魚[10]、青[11]、香魚[12]、鯉魚[13]、虹鱒[14]、石川氏鮭[15]、羅非魚[16－17]、牙鲆[18]和真鯛[19]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是分布于我國沿海的重要鲆鰈魚類之一，在海水養(yǎng)殖中占有重要地位，其年產(chǎn)量約為7 000 t。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴大，由于累代繁殖和近親交配引起了種質(zhì)的明顯退化?，F(xiàn)在培育的商業(yè)化苗種表現(xiàn)出生長速度降低、疾病抵抗力差、抗逆性差等缺點，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)者的經(jīng)濟(jì)效益。因此，培育具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的新品種、新品系已然成為牙鲆養(yǎng)殖的重要任務(wù)。傳統(tǒng)上采用動物模型BLUP方法結(jié)合家系選育技術(shù)進(jìn)行新品種選育研究。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的蓬勃發(fā)展，越來越多的標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)融入于優(yōu)質(zhì)品種選育過程中。分子標(biāo)記技術(shù)具有信息量大，不易受環(huán)境的影響，選擇強度大，選種效率和準(zhǔn)確性高等特點，已經(jīng)引起人們廣泛關(guān)注[20]。其中，微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、易于檢測、進(jìn)化所受選擇壓力小等特點，是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記之一。如：凡納濱對蝦、中國對蝦與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[21－22]；鯉魚與抗寒性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記篩選[23]；牙鲆耐高溫性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[24]。本研究以中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站2007誘導(dǎo)成功的雙單倍體牙鲆群體為材料[6]，尋找與生長性狀緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，以期為牙鲆良種選育研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站牙鲆選育基礎(chǔ)群體中性狀優(yōu)良雌性親魚，輕擠雌魚腹部獲得卵子，存儲于500 mL燒杯中。輕擠雄性真鯛腹部獲得精子，存儲于1.5 mL注射器中。真鯛精液用Ringer氏液按照1∶50的比例進(jìn)行稀釋。稀釋后的精液在15W×2的紫外線燈管（Toshiba，Japan）下進(jìn)行照射，照距為28～30 cm，時間為60 s。照射后的精液經(jīng)顯微鏡檢查活力，確認(rèn)充分活躍后，將真鯛精液與卵粒均勻混合（精卵體積比1∶10），室溫靜置2 min，加入14～16℃海水激活，并用玻璃棒輕度攪拌。將受精后1 h的受精卵轉(zhuǎn)移至靜水壓力機中，施壓650 kg·cm－2持續(xù)10 min，之后將卵移至14～16℃的海水中孵化，獲得雙單倍體實驗群體。培育群體至三年齡，記錄體重（Body weight，BW）、全長（Total length,TL）、體高（Body depth，BD）等主要生長性狀數(shù)據(jù)，選擇具有顯著差異的個體各30尾，作為快速生長組（Fast growth group，F(xiàn)GG）和慢速生長組（Slow growth group，SGG），每組個體生長性狀描述性統(tǒng)計量見表1。同時采集兩組相應(yīng)個體腹面鰭條，保存于－80℃冰箱中待用。

表1 FGG和SGG個體生長性狀表型值Table 1 Descriptive statistics of growth traits for FGG and SGG individuals

1.2 基因組DNA提取

將 裂 解 液（50 mmol·L－1NaCl， 30 mmol·L－1Tris－HCl， 200 mmol·L－1EDTA pH 8.0， 1% 的SDS，200 mg·L－1的蛋白酶K）加入剪碎的鰭條中，40℃消化至澄清，等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（24∶1∶1）抽提3次。等體積的去離子水稀釋，2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀，100 μL的70%乙醇清洗沉淀，TE溶解，－20℃保存待用。

1.3 微衛(wèi)星引物

40個微衛(wèi)星標(biāo)記參考牙鲆遺傳連鎖圖譜獲得引物序列[25]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，合成規(guī)格2.5 OD。引物名稱、引物序列、核心序列、退火溫度、連鎖群、GenBank登錄號見表2。

表2 牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記信息Table 2 Detailed information on microsatellite markers of Japanese flounder

續(xù) 表

1.4 PCR反應(yīng)及電泳

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括10×的buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol·L－1）1 μL、dNTPs（各2 mmol·L－1）1 mL、上下游引物（10 mmol·L－1）各1 μL、模板 1 μL（30～50 ng）、Taq DNA 聚合酶 1 U，加適量ddH2O。PCR反應(yīng)程序包括：94℃30 s，退火30 s，72℃ 30 s，28循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳后經(jīng)1%的硝酸銀染色10 min，顯色液（1%甲醛，2%氫氧化鈉，0.04%無水碳酸鈉）顯色10 min。凝膠在掃描儀上成像，Gel－Pro Analyzer 4.5軟件對電泳譜帶進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計分析

通過Gel－Pro Analyzer 4.5軟件分析電泳圖片計算等位基因片段大小，利用SAS8.2軟件分析生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點差異性等位基因片段篩選

表1中個體主要生長性狀表型值范圍分別為：FGG，體重（2 043.71～2 384.92）、全長（53.44～62.32）、體高（17.42～19.85）；SGG，體重（808.81～976.22）、 全 長（41.74～46.78）、 體 高（12.58～15.29），表明兩組個體生長性狀存在顯著差異。通過Gel－Pro Analyzer 4.5軟件分析電泳圖片，獲得FGG和SGG個體在不同位點的等位基因片段大小。40個微衛(wèi)星標(biāo)記掃描FGG和SGG個體基因組結(jié)果中，有Poli19TUF、Poli24MHFS、Poli150 TUF、Poli190TUF等4個位點在兩組內(nèi)出現(xiàn)了差異性等位基因片段。

2.2 微衛(wèi)星位點差異性等位基因片段統(tǒng)計

統(tǒng)計 Poli19TUF、Poli24MHFS、Poli150TUF、Poli190TUF位點在FGG和SGG中個體的擴增情況。表3中，同一標(biāo)記在不同組別中獲得了特異性的等位基因片段。Poli19TUF、Poli24MHFS、Poli190TUF位點在FGG中均有25個左右個體擴增出相應(yīng)的特異性片段，其出現(xiàn)率為83.33%～86.67%；而在Poli150TUF位點的出現(xiàn)率略低，為66.67%。SGG中Poli150TUF、Poli190TUF位點有23個左右個體擴增出相應(yīng)的特異性片段，其出現(xiàn)率為73.33%～80.00%；而Poli24MHFS、Poli19TUF位點出現(xiàn)率相對較低，為40.00%～60.00%。

2.3 微衛(wèi)星位點差異性等位基因片段與生長性狀的連鎖分析

利用SAS8.2軟件的GLM過程進(jìn)行牙鲆主要生長性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)性分析，統(tǒng)計4個位點差異性等位基因片段在FGG和SGG內(nèi)個體主要生長性狀之間的差異，尋找與性狀緊密連鎖的標(biāo)記。同一標(biāo)記具有特定差異性片段的兩組個體，在體重、全長、體高三個性狀上表現(xiàn)出顯著差異（見表4），表明Poli19TUF、Poli24MHFS、Poli 150TUF、Poli190TUF位點與生長性狀具有緊密的連鎖性。

表3 FGG和SGG差異性等位基因片段統(tǒng)計Table 3 Statistics of different banding patterns in FGG and SGG

表4 FGG和SGG差異性等位基因片段個體生長性狀比較Table 4 Comparison of different banding patterns in FGG and SGG individuals

3 討論與結(jié)論

魚類的生長性狀受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜；且由于生存在海淡水中，較畜牧業(yè)品種更加容易受到環(huán)境效應(yīng)的影響。目前，對于主要養(yǎng)殖魚類經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良多采取家系選育、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育等技術(shù)。利用這些方法，近些年先后培育出“夏奧1號”奧里亞羅非魚、吉鱺羅非魚、異育銀鯽“中科3號”、松浦鏡鯉、鰱“鄂豐1號”、加州鱸等優(yōu)良新品種（系）12個。其中，雌核發(fā)育技術(shù)在水產(chǎn)動物育種過程中發(fā)揮了越來越重要的作用。但是，所利用的多為減數(shù)分裂雌核發(fā)育技術(shù)，以固定母本性狀和建立高遺傳相似度家系為主要手段。很少以誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育獲得的雙單倍體為親本培育新品種，用此材料進(jìn)行分子標(biāo)記與經(jīng)濟(jì)性狀的連鎖分析也未見報道。

本研究利用已經(jīng)制備的雙單倍體牙鲆按照體重等主要生長性狀表型值分成FGG和SGG探索標(biāo)記與生長性狀的相關(guān)性，這種分群分離分析法能夠快速鑒定與特定基因相連鎖的標(biāo)記[26]。類似方法在其它魚類中也有報道，如：羅非魚[27]、鯉魚[28]、大菱鲆[29]。本研究從Coimbra等發(fā)表的遺傳連鎖圖譜上選擇了40個高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，覆蓋了牙鲆24個連鎖群中的22個，分析結(jié)果表明：4個標(biāo)記與生長性狀顯著相關(guān)[25]。王桂興等初步報道了牙鲆與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，找到了8個與生長性狀相關(guān)標(biāo)記。其使用材料為隨機減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系，在同一位點出現(xiàn)了多種個體基因型，且為雜合態(tài)；如Poli123TUF位點出現(xiàn)了6種基因型；這一點不利于標(biāo)記與性狀的連鎖分析[30]。在此基礎(chǔ)上，本研究首次采用雙單倍體牙鲆為材料，其遺傳背景完全純合，在一個位點只有兩種基因型，便于更加準(zhǔn)確的分析標(biāo)記與性狀的相關(guān)性。同時，分析的標(biāo)記數(shù)量也增加到40個；其中，3個相關(guān)標(biāo)記Poli24MHFS、Poli150TUF、Poli190TUF即為新增標(biāo)記。本試驗檢測出的4個相關(guān)標(biāo)記分布于3個連鎖群，表明控制牙鲆生長性狀的基因有多個且位于不同連鎖群，這一點與王桂興等[30]結(jié)果相同。此外，本研究分析的3個主要生長性狀：體重、全長、體高，三者之間存在高度的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)[31－32]，若標(biāo)記與其中1個性狀相關(guān)，與其余2個性狀也應(yīng)出現(xiàn)相關(guān)性，這一推斷在本研究結(jié)果中得以輔證（4個標(biāo)記與3個性狀均呈顯著相關(guān)）。當(dāng)然魚類品種眾多、形態(tài)各異，處于不同的發(fā)育時期和階段使得不同生長性狀之間的相關(guān)性也可能存在不同規(guī)律。借助分子標(biāo)記技術(shù)挖掘出與性狀緊密連鎖的標(biāo)記，如果將個體標(biāo)記效應(yīng)作為隨機效應(yīng)加入到動物模型等遺傳評估模型中，能夠讓性狀遺傳力和個體育種值估計更加精確，推動具有特定經(jīng)濟(jì)性狀的新品種或新品系的選育進(jìn)程，縮短選育周期，提高遺傳進(jìn)展。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，從過去的DNA指紋圖譜技術(shù)、同工酶標(biāo)記到微衛(wèi)星、SNP標(biāo)記也僅僅用了短暫的時間。伴隨著鯉魚全基因組測序的啟動，全基因組測序技術(shù)在水產(chǎn)動物的應(yīng)用已經(jīng)展開，牙鲆、半滑舌鰨、大黃魚等品種都已經(jīng)完成測序，處于組裝、拼接和注釋階段。未來的品種選育與性狀遺傳改良必將借助于這些新興的技術(shù)，深入到基因組水平的層次上詮釋個體的生長發(fā)育過程。因此，在完成挖掘生長相關(guān)標(biāo)記的基礎(chǔ)上，本研究將繼續(xù)利用牙鲆遺傳圖譜和基因組信息定位目的基因，真正發(fā)揮出分子標(biāo)記技術(shù)在育種中的有效性和實用性。

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