楊永華，邵 強*，皮川真，楊全中，蘇志國

（1.河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.華蘭生物工程有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453007；3.中國科學院過程工程研究所，北京 100190）

人腸道病毒7l型（EV71）是小RNA病毒科，人腸道病毒屬的成員[1]，主要在腸道內(nèi)進行復制[2]。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構，無包膜和突起,直徑大約在24～30 nm，核酸為單股正鏈RNA。病毒粒子的衣殼由60個亞單位構成，后者又是由四種衣殼蛋白VP1～VP4拼裝成的五聚體樣結(jié)構[1]。自1969年，第一株EV7l病毒從美國加利福尼亞州一名患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒體內(nèi)分離出來[3]。從此以后，EV71在全球范圍內(nèi)逐漸流行，從20世紀70年代主要在保加利亞，匈牙利等歐洲國家流行，直至20世紀90年代起，EV7l開始肆虐東南亞地區(qū)、日本、馬來西亞、中國臺灣、中國大陸等地均深受其害[4-9]。

EV71感染主要引起患者手足口病，在臨床上與柯薩奇病毒A16（Coxsakie A16，CAl6）感染所引起的手足口病難以區(qū)別，兒童感染后部分出現(xiàn)多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關的嚴重并發(fā)癥，包括神經(jīng)源性肺水腫、腦干腦炎和心肌炎心衰等，神經(jīng)源性肺水腫多在12 h內(nèi)死亡率且病死率極高[1]。近年來，EV71病毒流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢[10-12]，2008年3月安徽阜陽暴發(fā)流行EV7l型相關性手足口病，隨后東南沿海及內(nèi)陸地區(qū)也相繼暴發(fā)EV71手足口病[13]。EV71的爆發(fā)和流行已經(jīng)引起各國政府和科研工作者的注意，如何對其進行有效的預防日益受到人們的重視。

凝膠過濾層析法又稱凝膠過濾排阻層析或分子篩層析，是60年代初發(fā)起來的一種簡便而有效的液相柱層色譜技術。利用某些化學惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構的物質(zhì)（凝膠）為填料，通過洗脫液的連續(xù)洗脫，使混合物種的各種物質(zhì)按其分子大小不同得到分離。凝膠過濾層析所需設備簡單、操作方便、分離迅速，不影響樣品的生物活性等特點，廣泛用于大分子物質(zhì)的分離純化，也應用于蛋白質(zhì)去鹽及分子量的測定。這種方法條件溫和、簡便、分離范圍廣、回收率高[14]。凝膠過濾層析對EV71病毒粗體液的最佳分離效果受許多因素的影響。本文探討了洗脫流速、上樣量、緩沖液的pH和鹽濃度對EV71病毒粗體液分離效果的影響，為凝膠過濾層析分離人類腸道病毒的應用提供了可靠的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

試劑：標準蛋白（192 μg·mL-1）（Sigma）；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉（天津科密歐化學試劑有限公司）；Tris（Angus chemical）；鹽酸（洛陽昊華化學試劑有限公司）；氯化鈉（中鹽宏博集團云夢云虹制藥有限公司）。

上柱樣品：EV71培養(yǎng)原液。

層析緩沖液：

PB緩沖液1：20 mmol·L-1PB+100 mmol·L-1氯化鈉，將pH分別調(diào)為7.0、7.5及8.0；

PB緩沖液2：20 mmol·L-1PB+1 mol·L-1氯化鈉，將pH調(diào)為7.5；

Tris緩沖液：20 mmol·L-1Tris-HCl+100 mmol·L-1氯化鈉，將pH分別調(diào)為8.5及9.0；

1.2 方法

1.2.1 洗脫流速對EV71病毒粗提液分離效果的影響

EV71病毒粗提液分別上樣同一sepharose 4FF凝膠過濾柱（Φ2.6 cm×70 cm），用0.02 mol·L-1PBS緩沖液平衡至電導，280、260和330 nm吸光值和pH不再變化，加入相同體積的樣品，分別以15、30、45、60和75 cm·h-1流速洗脫后，在線檢測280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，檢測每洗脫條件下的第一峰蛋白含量、滴度和效價。

1.2.2 樣品上樣量對EV71病毒粗提液分離效果的影響

用0.02 mol·L-1PBS緩沖液平衡至電導，280、260和330 nm吸光值和pH不再變化，加入不同體積的樣品（即1%CV、2%CV、3%CV、4%CV、5%CV），不同體積的樣品一次以以60 cm·h-1的流速用緩沖液進行連續(xù)洗脫，在線監(jiān)測280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，檢測每洗脫條件下的第一峰蛋白含量、滴度和效價。

1.2.3 緩沖液pH值對EV71病毒粗提液分離效果的影響

用不同pH緩沖液（pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）作為流動相來平衡sepharose 4FF使電導，280、260和330 nm吸光值和pH值不再變化，加入相同體積的樣品，以60 cm·h-1的流速用緩沖液（不同pH緩沖液，即pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）進行連續(xù)洗脫，在線監(jiān)測280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，檢測每洗脫條件下的第一峰蛋白含量、滴度和效價。

1.2.4 鹽濃度對EV71病毒粗體液分離效果的影響

分別用含0.1、 0.2、 0.3 mol·L-1NaCl和 0.4 mol·L-1NaCl PBS緩沖液（pH 7.5）平衡至電導，280、260和330 nm吸光值和pH不再變化，加入相同體積的樣品，以60 cm·h-1的流速分別用含0.1、0.2、 0.3和 0.4 mol·L-1NaCl PBS緩沖液（pH 7.5）連續(xù)洗脫，在線監(jiān)測280、260和330 nm吸光值，收集第一峰45 mL，檢測每洗脫條件下的第一峰蛋白含量、滴度和效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫流速對EV71病毒粗提液分離效果的影響

EV71病毒粗提液分別上樣同一sepharose 4FF凝膠過濾柱，分別以30、45、60和75 cm·h-1的流速洗脫后，洗脫曲線見圖1。當分別以30、45、60和75 cm·h-1的速度洗脫時（見圖1），都展現(xiàn)出3個明顯的峰；當以60 cm·h-1的速度洗脫時，在前者的第1個峰后緊挨著又出現(xiàn)一個不明顯的小峰，總共展現(xiàn)出4個峰。且僅就第1峰的峰形而言，以60 cm·h-1的速度洗脫時的分離效果更好一些。通過檢測層析后所收集樣品的效價和滴度值（見表1），也是以60 cm·h-1的流速洗脫時，所檢測得到的值更好一些?？梢娫诒緦嶒炈x擇的5個洗脫流速中，以60 cm·h-1的流速對人類腸道病毒粗提液的分離效果較好。

圖1 不同的流速對EV71病毒粗提液的分離效果Fig.1 Different velocity of EV71 virus coarse extraction separation effect of liquid

表1 層析不同的流速對人類腸道病毒第一峰所收集樣品的效價和滴度值(n=4)Table 1 Chromatography different velocity of human intestinal virus that first submmit sample collection titer and drip degrees values(n=4)（cm·h-1）

2.2 樣品上樣量對EV71病毒粗提液分離效果的影響

EV71病毒粗體液經(jīng)同一sepharose 4FF凝膠過濾層析柱，不同上樣量，同一pH緩沖液連續(xù)洗脫后，洗脫曲線見圖2。不同體積的上樣量，所層析出來的峰型不同，上樣量在一定范圍內(nèi)與第一峰是成線性關系的，但大達到一定量后，第一峰的值并不隨上樣量的增加而增高，而是增加峰的寬度。綜合各項檢測指標得出（見表2），樣品上樣量為5%CV時EV71病毒粗體液的分離效果較好。

圖2 不同的上樣量對EV71病毒粗提液的分離效果Fig.2 Different sample weight to EV71 virus on coarse extraction separation effect of liquid

表2 層析不同的上樣量對EV71病毒第一峰所收集樣品的效價和滴度值(n=4)Table 2 Chromatography different sample weight to EV71 virus on the first peak by sample collection titer and drip degrees values(n=4)

2.3 緩沖液pH對EV71病毒粗提液分離效果的影響

凝膠過濾層析EV71病毒粗體液時，pH對其影響很大，當pH過高或過低時，將導致EV71病毒變性。層析圖譜各pH條件差異不大，但通過檢測所收集第一峰的樣品效價和滴度（見表3），比較得出pH為7.5時，EV71病毒粗提液的分離效果較好。

表3 不同pH值對EV71病毒第一峰所收集樣品的效價和滴度值(n=4)Table 3 Pifferent hydrogenion concentration to EV71 virus on the first peak by sample collection titer and drip degrees values(n=4)

2.4 鹽濃度對EV71病毒粗體液分離效果的影響

采用逐步提高平衡緩沖液中氯化鈉的濃度盡可能使更多雜蛋白流穿出來，從而使EV71病毒比活更高。從層析圖譜上看，不同鹽離子濃度的層析峰形基本一致但就第一個峰（經(jīng)前面試驗所得本試驗所要抗原所在的峰）而言緩沖液含0.1 mol·L-1NaCl時，其吸光值最高，經(jīng)檢測所收集第一峰的樣品效價和滴度（見表4），從效價上看，0.1 mol·L-1NaCl最高，0.2 mol·L-1NaCl效價很低，其他的基本和空白對照一致，即沒有檢測到效價。從滴度上看，也是0.1 mol·L-1NaCl滴度最高，其他鹽離子濃度下病變不高或沒有病變。綜合考慮當緩沖液含鹽濃度為0.1 mol·L-1對EV71病毒粗提液的分離效果較好。

表4 層析不同鹽離子濃度第一峰樣品的效價和滴度值(n=4)Table 4 Chromatography different salt ions concentration first submmit samples titer and drip degrees values(n=4)

3 討論與結(jié)論

由于凝膠過濾層析的分離機理尚未完全明了，其分離效果與洗脫流速之間的關系還沒有一個定論，不同的試驗結(jié)果分歧很大，甚至得出截然不同的結(jié)論[15]。究其原因可能是各種物質(zhì)的理化性質(zhì)各不相同，在分離過程中不可能與凝膠完全排阻，還存在其他作用影響其分離效果。本試驗選擇了30、45、60和75 cm·h-14個洗脫流速，且僅就第1峰的峰形而言，只有以60 cm·h-1的流速洗脫時，總體分離效果最理想，推測EV71病毒粗體液與凝膠間可能存在著如絡合反應之類的非物理作用。通過檢測層析后所收集樣品的效價和滴度值，也是以60 cm·h-1的流速洗脫時，所檢測得到的值更好一些。

樣品上樣量對EV71病毒粗提液分離效果的影響：EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構，無包膜和突起，直徑大約在24～30 nm[1]，遠遠大于病毒培養(yǎng)液中的雜蛋白分子。根據(jù)凝膠柱層析原理，病毒顆粒最先被洗脫下來，當樣品上樣量較小時，病毒與雜蛋白被徹底分開，即上樣量在一定范圍內(nèi)與第一峰是成線性關系的，即隨著上樣量的增加峰值增高；但超過一定量后，第一峰的值并不隨上樣量的增加而增高，而是增加峰的寬度，這樣可能造成第一峰和第二峰分離不開。

緩沖液pH和鹽濃度對EV71病毒粗提液分離效果的影響：緩沖液pH和鹽濃度對凝膠過濾層析的峰型影響不明顯，但對生物制品的活性有較大的影響。EV71病毒的生物活性與pH和鹽濃度有關，有最佳的生物環(huán)境。從我們的結(jié)果可以看出，它在pH為7.5，鹽濃度為100 mmol·L-1最理想。

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