朱雙杰，孟先科，張 瑩，陳 熙

（滁州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，滁州 安徽 239000）

腸道是動(dòng)物機(jī)體最大的儲(chǔ)菌庫(kù)[1]。正常情況下，腸道菌群對(duì)宿主的作用以及它們之間的相互作用有重要的生物學(xué)意義，在宿主生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中，許多生理、免疫功能的完善，均有賴于腸道菌群的輔助，腸道菌群之間平衡是建立在相互拮抗、協(xié)同基礎(chǔ)上的[2]。一旦這種平衡遭到破壞，就造成微生態(tài)失調(diào)，將導(dǎo)致免疫力下降及各種疾病的發(fā)生[3－4]。微生態(tài)失調(diào)表現(xiàn)為細(xì)菌數(shù)量改變、菌群比例上的失調(diào)和細(xì)菌空間上的轉(zhuǎn)移[2]。有關(guān)菌群比例失調(diào)和細(xì)菌空間上的轉(zhuǎn)移對(duì)機(jī)體免疫力的影響有過(guò)報(bào)道[5]，而有關(guān)腸道細(xì)菌數(shù)量的變化對(duì)機(jī)體免疫力的影響未見(jiàn)報(bào)道。銅石龍子（Sphenomorphus indicus）捕食農(nóng)林害蟲(chóng)，有益于農(nóng)林業(yè)，具有重要的生態(tài)價(jià)值；可入藥，破石林，止癢，利小便，又具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。野外的銅石龍子由于環(huán)境的變化而瀕臨衰退，同時(shí)人工的養(yǎng)殖又存在困難，因此研究影響銅石龍子的免疫機(jī)能的因素有很重要的意義。本試驗(yàn)以大黃、板藍(lán)根為手段改變銅石龍子腸道細(xì)菌的數(shù)量，以探討腸道細(xì)菌數(shù)量變化是否與銅石龍子免疫機(jī)能具有相關(guān)性，以期為蜥蜴類的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集與培養(yǎng)

銅石龍子采集與瑯琊山，先用面包蟲(chóng)喂養(yǎng)7 d，再隨機(jī)分成3組，每組25只：A組于飲用水中添加2%大黃、B組于飲水中添加2%板藍(lán)根、C組飲水中不加中草藥作對(duì)照，均于上午9：00喂飲。試驗(yàn)取樣于第1、2、4、7、14、21和28天進(jìn)行。

1.2 培養(yǎng)基

淡水魚(yú)瓊脂培養(yǎng)基（FWA）[5]。

1.3 腸道菌群計(jì)數(shù)

1.3.1 菌液制備

取新鮮的糞便0.1 g，加水10 mL，勻漿，準(zhǔn)確移取0.5 mL勻漿液，加4.5 mL無(wú)菌水，制成原液，10倍稀釋法，稀釋到107倍。

1.3.2 細(xì)菌的計(jì)數(shù)

平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.4 血清溶菌酶活性的測(cè)定

1.4.1 采血樣制備血清

取樣分別在開(kāi)始投藥餌前和投藥餌后第1、2、4、7、14、21和28天的上午9：00進(jìn)行。各組蜥蜴斷頭法取血，將血直接放入滅菌的離心管中封口，置室溫下 l h，再以 2 000 r·min－1離心15 min，分離血清（用于溶菌酶活性的測(cè)定）。每次取樣3條，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 溶菌酶活性的測(cè)定

酶活測(cè)定參照賈長(zhǎng)虹[6]、李莉[5]的方法進(jìn)行。

1.5 血液白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定

巨噬細(xì)胞活性的測(cè)定參照李莉[5]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲食大黃和板藍(lán)根后銅石龍子腸道細(xì)菌數(shù)量的變化特征

結(jié)果見(jiàn)表1，銅石龍子腸道細(xì)菌數(shù)量在服用大黃、板藍(lán)根后均上升，第2天均高于對(duì)照組，大黃達(dá)（5.18±0.15）×107cfu·g－1，差異極顯著（P＜0.01），板藍(lán)根組達(dá)（4.59±0.32）×107cfu·g－1，達(dá)顯著水平（P＜0.05）。第4天達(dá)到最大值，大黃組達(dá)（7.99±0.20）×107cfu·g－1（P＜0.01），板藍(lán)根組達(dá)（6.14±0.31）×107cfu·g－1，相對(duì)于對(duì)照組，差異極顯著（P＜0.01）。而后腸道細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，第7天及以后測(cè)得數(shù)據(jù)，大黃組和板藍(lán)根組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。說(shuō)明：喂飲大黃和板藍(lán)根后，銅石龍子腸道細(xì)菌數(shù)量有變化，其變化特征為：初期銅石龍子的腸道細(xì)菌的數(shù)量是增加的，但隨之腸道細(xì)菌數(shù)量很快下降至對(duì)照水平。

表1 喂飲大黃、板藍(lán)根后銅石龍子腸道細(xì)菌數(shù)量的變化Table 1 Change of number of bacteria in skink's alimental tract after drinking rhubarb and isatidis root(107cfu·g-1)

2.2 喂飲大黃和板藍(lán)根后銅石龍子蜥蜴血液中溶菌酶活性的變化

溶菌酶為正常機(jī)體免疫防御機(jī)制的組成部分，具有溶解病原細(xì)菌細(xì)胞壁的作用。結(jié)果見(jiàn)表2，銅石龍子在喂飲大黃和板藍(lán)根后，銅石龍子血液中溶菌酶活性呈上升趨勢(shì)。大黃組：第2天達(dá)84.72±0.35 μg·mL－1，方差分析，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第7天及以后測(cè)得數(shù)據(jù)為113.04±0.31、116.52±0.29、98.37±0.43 和 102.33±0.31 μg·mL－1，均顯著高于對(duì)照組，差異極顯著（P＜0.01）。板藍(lán)根組：溶菌酶的活性從第2天達(dá)到104.31±0.27 μg·mL－1，顯著高于對(duì)照組，方差分析差異極顯著（P＜0.01），第4、7、14、21、28天此所測(cè)溶菌酶的活性均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。說(shuō)明：喂飲大黃和板藍(lán)根后，銅石龍子血液溶菌酶的活性顯著增加。

表2 喂飲大黃和板藍(lán)根后銅石龍子血液溶菌酶活性的變化Table 2 Effect of rhubarb and isatidis root on activity of lysozyme of microphage in blood of skink（μg·mL-1）

2.3 喂飲大黃和板藍(lán)根后白條草蜥體液中抗體含量的變化

由表3可知，在喂飲大黃和板藍(lán)根，兩組后均表現(xiàn)出對(duì)抗原的免疫應(yīng)答現(xiàn)象。兩試驗(yàn)組在免疫后第4天兩試驗(yàn)組的OD值分別為0.40、0.38，相比對(duì)照組的抗體效價(jià)OD值0.23差異顯著（P＜0.05），出現(xiàn)了免疫應(yīng)答效應(yīng)；并且，抗體效價(jià)繼續(xù)上升，兩試驗(yàn)組在第7、14、21、28天大黃組的OD值分別為0.68、0.74、0.62、0.60，板藍(lán)根組的OD值分別為0.60、0.67、0.50、0.55，抗體效價(jià)的OD值均極顯著高于對(duì)照組的OD值（P＜0.01）。說(shuō)明在喂飲大黃和板藍(lán)根后，白條草蜥血液抗體效價(jià)均顯著增加。

表3 大黃和板藍(lán)根對(duì)白條草蜥體液中抗體效價(jià)的影響（OD490nm）Table 3 Effect of rhubarb and isatidis root on antibody's valence in blood of takydromus wolteri

2.4 喂飲大黃和板藍(lán)根后銅石龍子血液中白細(xì)胞吞噬活性的變化

巨噬細(xì)胞來(lái)自血液中單核細(xì)胞，內(nèi)含溶酶體，具有粘附能力和強(qiáng)大的吞噬功能，在生物體內(nèi)是扮演清道夫角色，巨噬細(xì)胞的活性表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是全部巨噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)，另一個(gè)是每個(gè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

由表4可知，大黃組，血液中的白細(xì)胞吞噬百分比在第7天為（70.69%±0.26%），顯著高于對(duì)照組（55.69%±0.38%）（P＜0.05），并隨著喂藥飼養(yǎng)天數(shù)的增加而上升，吞噬百分比在14 d達(dá)到（78.75±0.37），極顯著的高于對(duì)照組（57.32%±0.39%）（P＜0.01），吞噬百分比在21、28 d分別為（77.83%±0.36%）、（77.67%±0.28%），均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。板藍(lán)根組，第4天吞噬百分比為（64.19%±0.40%），顯著高于對(duì)照組（57.83%±0.32%）（P＜0.05），此后血細(xì)胞的吞噬百分比均顯著高于對(duì)照組，其中在第21、28天的吞噬百分比為（70.49%±0.32%）、（67.77%±0.30%），于對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明：銅石龍子在飲用大黃和板藍(lán)根后，巨噬細(xì)胞的活性先呈上升趨勢(shì)，很快高于對(duì)照組，并與對(duì)照組保持顯著差異。

在喂飲大黃和板藍(lán)根后，銅石龍子巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（PI）上升。大黃組，吞噬指數(shù)在第4天為（1.99%±0.05%），開(kāi)始和對(duì)照組1.83±0.07顯出差異（P＜0.05），第 7天吞噬指數(shù)達(dá)（2.08%±0.05%），和對(duì)照組1.82表現(xiàn)出差異極顯著（P＜0.01），這種極顯著的差異保持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。板藍(lán)根組，在喂飲大黃和板藍(lán)根后，吞噬指數(shù)迅速上升，第2天的吞噬指數(shù)為1.95。相比對(duì)照組（1.81%±0.06%），差異顯著（P＜0.05），第4天的吞噬指數(shù)為（2.04%±0.02%），顯著高于對(duì)照組（1.83%±0.07%），方差分析差異極顯著，此后的吞噬指數(shù)均極顯著的高于對(duì)照組（P＜0.01），（見(jiàn)表5）。說(shuō)明銅石龍子在飲用大黃、板藍(lán)根后，每個(gè)巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)明顯增加。

表4 喂食大黃、板藍(lán)根后銅石龍子血液巨噬細(xì)胞吞噬百分比的變化Table 4 Effect of rhubarb and isatidis root on phagocytic percentage of microphage in blood of skink(%)

表5 大黃和板藍(lán)根對(duì)銅石龍子噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響Table 5 Effect of rhubarb and isatidis root on phagocytic indices of microphage in blood of skink

由以上兩個(gè)結(jié)果的分析可以看出，銅石龍子在飲用大黃和板藍(lán)根后，其血液里的巨噬細(xì)胞的吞噬活性迅速增加，并保持著和對(duì)照組的顯著差異。

3 討論

腸道細(xì)菌在腸道中起著生物屏障，有選擇性地抑制外源細(xì)菌的作用，使之不能定植[7]。消化道菌群除了直接抑制致病菌定植之外，還對(duì)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[8]。動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群對(duì)于維護(hù)機(jī)體自身的免疫力有重要的作用，其免疫指標(biāo)如巨噬細(xì)胞、免疫球蛋白、抗體等都與腸道細(xì)菌有著密切的相關(guān)性[9]。腸道細(xì)菌數(shù)量改變或種群比例上的失調(diào)或細(xì)菌空間上的轉(zhuǎn)移都可能是影響動(dòng)物體的免疫力因素。在本試驗(yàn)中，銅石龍子在飲用大黃和板藍(lán)根后，其消化道細(xì)菌數(shù)量變化特征是先增加，但很快就降至對(duì)照組水平，而與動(dòng)物體免疫力相關(guān)的抗體效價(jià)、溶菌酶活性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力是很快增加的，并且在增加后均保持著和對(duì)照組顯著的差異。腸道細(xì)菌變化的特征明顯和免疫力相關(guān)的抗體效價(jià)、溶菌酶的活性和巨嗜細(xì)胞的活性變化特征不同，沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性，說(shuō)明腸道細(xì)菌數(shù)量的變化沒(méi)有對(duì)石龍子的免疫力產(chǎn)生影響。但本實(shí)驗(yàn)中，銅石龍子的免疫力表現(xiàn)出了增強(qiáng)，這有可能是大黃和板藍(lán)根本身引起的，也可能是大黃和板藍(lán)根引起腸道菌群比例改變，益生菌在腸道內(nèi)比例增加，從而增強(qiáng)了銅石龍子的免疫機(jī)能，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

a.大黃和板藍(lán)根對(duì)白條草蜥的免疫力具有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用表現(xiàn)在大黃和板藍(lán)根提高了白條草蜥的抗體效價(jià)、溶菌酶活性以及巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

b.大黃和板藍(lán)根對(duì)白條草蜥腸道細(xì)菌數(shù)量的改變有一定的作用，但這種作用與白條草蜥的免疫力無(wú)直接相關(guān)性。

[1] 金顯文,黃山,吳孝兵.山地麻蜥消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)研究[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2008,17(1):51-55.

[2] 康白.微生態(tài)學(xué)[M].大連:大連出版社,1988,110-119.

[3] 梁慶紅,張琳,段恕誠(chéng),等.腸道菌群失調(diào)對(duì)小鼠免疫和造血功能狀態(tài)的影響[J].中華兒科雜志,2004,42(9):711.

[4] 王堅(jiān)錢,湯瑾.益生菌對(duì)大鼠腸道菌紊亂和細(xì)菌易位的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,2(26):163-165.

[5] 李莉.草魚(yú)腸道菌群的變化和免疫機(jī)能的關(guān)系[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[6] 賈長(zhǎng)虹,李向東,劉海山.溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)酶活曲線測(cè)定方法的改進(jìn)[J].河北理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,31(3):121-123.

[7] 韓海棠.競(jìng)爭(zhēng)性排斥培養(yǎng)物對(duì)肉雞沙門氏菌定植、免疫力及血液生化指標(biāo)的影響[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.

[8] 劉偉,丁偉群.益生菌對(duì)結(jié)腸炎大鼠乳膜細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中華消化雜志,2006,5(12):801-803.

[9] 易力,汪洋.不同微生態(tài)制劑對(duì)肉仔雞免疫器官指數(shù)和紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2005,10(4l):14-16.