崔 陽(yáng)，王 冰，徐 剛，邊 棟，李艷華*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

泰樂(lè)菌素是一種畜禽專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，作為促進(jìn)生長(zhǎng)用的添加劑在國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)中已廣泛應(yīng)用。在我國(guó)，泰樂(lè)菌素仍然屬于限制使用的藥物飼料添加劑。然而2006年歐盟成員國(guó)全面禁止使用抗生素作為促生長(zhǎng)劑。但對(duì)于活體動(dòng)物出口的檢疫，無(wú)法采用動(dòng)物組織或臟器直接測(cè)量，因而進(jìn)行血液中泰樂(lè)菌素含量的測(cè)量來(lái)標(biāo)示泰樂(lè)菌素在體內(nèi)組織中的殘留情況。到目前為止，我國(guó)尚無(wú)有關(guān)豬血清中泰樂(lè)菌素殘留的可靠分析方法。報(bào)道的檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類的方法主要有高效液相色譜法[1－2]、氣/質(zhì)聯(lián)用法[3]、液/質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS或LC－MS/MS)[4－10]。

本試驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）技術(shù)對(duì)血清樣品中的泰樂(lè)菌素進(jìn)行分析?？朔搜迦恿啃〉南拗?，且MS具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，可以在極低的濃度下進(jìn)行精確的定量，因此本試驗(yàn)可以對(duì)血清中微量泰樂(lè)菌素進(jìn)行快速鑒別和測(cè)定，同時(shí)也對(duì)泰樂(lè)菌素在豬體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供了檢測(cè)方法。豬血清中泰樂(lè)菌素的檢測(cè)限達(dá)到0.2 ng·mL－1，回收率及精密度結(jié)果滿意。豬血清中泰樂(lè)菌素的檢測(cè)方法，作者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

甲醇－HPLC級(jí)（Dimammd），乙腈－HPLC級(jí)（Fisher），泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma），乙酸、乙酸銨－分析純（科密歐），SEP－Vac C18固相萃取柱3 mL，200mg填料（Waters），去離子水（Milli－Q），5種不同來(lái)源的空白血清樣品（香坊試驗(yàn)豬場(chǎng)）。

1.1.2 儀器

Water ACQUITY UPLC超高壓高效液相色譜儀串聯(lián)Quattro Premier XE三重四級(jí)質(zhì)譜。質(zhì)譜采用電噴霧電離原，MassLynx4.1的軟件控制系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH－C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（A）和0.2%乙酸（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（見(jiàn)表1）。流速0.25 mL·min－1，柱溫30℃，5 μL進(jìn)樣。

表1 超高效液相色譜分析的流動(dòng)相的組成與梯度Table 1 Composition and gradient of the mobile phase for UPLC analysis

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI+模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓25 V；源溫度110℃；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流量50 L·h－1；脫溶劑氣流量550 L·h－1。碰撞氣體為氬氣，碰撞室壓力3.3×10－3mbar，定性和定量的離子及其碰撞能量等質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。泰樂(lè)菌素離子碎片及斷裂方式見(jiàn)圖1。

圖1 泰樂(lè)菌素離子碎片質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of the Tylosin

表2 泰樂(lè)菌素的定性和定量離子質(zhì)譜條件Table 2 Precursor ions and product ions of the Tylosin in the positive ion mode

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱量20.00 mg泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配置成濃度為200 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1，于4℃冰箱保存待用。移取1.0 mL儲(chǔ)備液Ⅰ至100 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻線，配置成濃度為2 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液Ⅱ。將儲(chǔ)備液用用乙腈－0.2%乙酸（30∶70，V/V）溶液分別稀釋為0.5、1、5、10和50 ng·mL－1等系列標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.2.4 樣品的提取和凈化

準(zhǔn)確量取0.5 mL血清至25 mL離心管中，加入2 mL 0.05 mol·L－1pH4 的乙酸銨溶液，加入 0.5 g NaCl，準(zhǔn)確移取5 mL乙腈加入離心管中。旋渦振蕩5 min，2 600 r·min－1離心 3 min。離心后取上清液2.5 mL置于另一15 mL離心管中，50℃氮吹至盡干。

采用Sep－Vac C18固相萃取柱進(jìn)行凈化。3 mL甲醇活化固相萃取（SPE）小柱，5 mL水平衡小柱，用2.5 mL 0.05 mol·L－1pH 4的乙酸銨溶液溶解濃縮的樣品通過(guò)固相萃取柱，再用每次1 mL的乙酸銨溶液2次重復(fù)溶解樣品，通過(guò)SPE小柱。待樣品全部經(jīng)過(guò)SPE小柱后，減壓抽干30 s。用5 mL 5%氨水－甲醇溶液洗脫，洗脫液接于15 mL離心管中，50℃氮吹至盡干。

濃縮后的樣品殘?jiān)?，? mL流動(dòng)相－乙腈：0.2%乙酸（30∶70）震蕩溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性

試驗(yàn)分別選用了五組來(lái)自不同源豬的血清進(jìn)行分析，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)（1.2.4）樣品的提取和凈化處理后，血清中并沒(méi)有干擾物質(zhì)對(duì)此檢測(cè)方法造成影響，且該血清可作為空白血清進(jìn)行試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品圖和血清樣品圖見(jiàn)圖2。

圖2 含有血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品圖及空白血清樣品圖Fig.2 MRM chromatogram of porcine serum and added with Tylosin standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

選取0.5、1、5、10和50 ng·mL－15個(gè)濃度配置成以血清為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。平行做兩組進(jìn)行測(cè)定，以藥物濃度（ng·mL－1）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢钥闯鎏?lè)菌素在0.5～50 ng·mL－1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.9994。線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 豬血清中泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curve of Tylosin in swine serum

2.3 靈敏度與精密度

對(duì)于測(cè)定豬血清中的泰樂(lè)菌素的精密度與重現(xiàn)性的考察，將配置好的一定濃度血清為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比（S/N）＞3為方法最低檢出限，為 0.06 ng·mL－1，（S/N）＞10 為方法最低定量限為0.2 ng·mL－1。在同一天內(nèi)對(duì)不同添加濃度的泰樂(lè)菌素對(duì)照品血漿各5份進(jìn)行分析測(cè)定；連續(xù)5 d對(duì)不同添加濃度的泰樂(lè)菌素對(duì)照品血漿進(jìn)行測(cè)定。日間與日內(nèi)RSD均＞13.5%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 回收率

添加一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液于0.5 mL空白血清樣品中，3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)添加的質(zhì)量濃度分別相當(dāng)于5、10和50 ng·mL－1的殘留量，每一濃度水平下作5個(gè)平行樣。添加后按照“2.3和2.4”節(jié)所述步驟進(jìn)行提取、凈化，UPLC－MS/MS測(cè)定，回收率在73%～84%之間。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 豬血清中泰樂(lè)菌素的日間、日內(nèi)差異和回收率結(jié)果（n=5）Table 4 Within-day and inter-day accuracy and recovery of Tylosin tartrate in porcine serum(n=5)

3 討論

在檢測(cè)方法選擇上，內(nèi)標(biāo)法是相對(duì)準(zhǔn)確的方法，但是泰樂(lè)菌素的同位素－D內(nèi)標(biāo)難以獲得。若選擇其他物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)化合物的話，即使是結(jié)構(gòu)相近，但是ESI接口方式本身就造成了不同化合物間的電離程度不同，因而本試驗(yàn)采用了混有血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品以基質(zhì)標(biāo)的方式，外標(biāo)法進(jìn)行定量。大量樣品分析時(shí)，與內(nèi)標(biāo)法相比，本方法在樣品的預(yù)處理上較簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了使用內(nèi)標(biāo)化合物的成本。

本試驗(yàn)采用5 μg·mL－1泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子[M+H]+，優(yōu)化錐孔電壓。然后以準(zhǔn)分子離子為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選取豐度較強(qiáng)的3對(duì)子離子，優(yōu)化其碰撞能量、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等質(zhì)譜參數(shù)。由于樣品基質(zhì)會(huì)對(duì)泰樂(lè)菌素電離造成影響，當(dāng)預(yù)處理方法完成后，采用混有血清為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)質(zhì)譜分析，再最終選擇出豐度最強(qiáng)的兩對(duì)子離子。母離子[M+H]+（m/z 916.9），兩個(gè)子離子碎片為失去部分糖結(jié)構(gòu)的[M+H]+（m/z 772.4），和質(zhì)子化的結(jié)構(gòu)碎片[M+H]+（m/z 174.4）作為MRM參數(shù)。

采用ESI+方式進(jìn)行監(jiān)測(cè)離子，酸性流動(dòng)相有利于泰樂(lè)菌素的電離。乙酸銨作為流動(dòng)相能很好的控制待分析物的峰型，但與乙酸相比抑制了泰樂(lè)菌素電離。為了獲得更高的靈敏度，實(shí)驗(yàn)選用了0.2%乙酸作為流動(dòng)相。采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分離樣品，1.7 μm的填料顆粒在分離血清樣品時(shí)，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，使用等度洗脫時(shí)，易造成內(nèi)源性物質(zhì)在色譜柱上的蓄積從而降低色譜柱效影響色譜峰峰形，所以在本試驗(yàn)中選擇梯度洗脫，減少內(nèi)源性物質(zhì)的蓄積使得峰形更銳，并且使色譜柱的壽命大大增長(zhǎng)。

試驗(yàn)在前處理過(guò)程中，對(duì)血清樣品的凈化采用了固相萃取方式。泰樂(lè)菌素為中等極性，因而試驗(yàn)選用采用Sep－Vac C18柱和Osisa HLB柱進(jìn)行樣品凈化，采用乙酸銨溶解樣品通過(guò)小柱，偏酸性的環(huán)境有利于泰樂(lè)菌素在C18這種填料的固相萃取小柱上吸附。C18為反向柱，可利用其溶劑強(qiáng)度的變化控制泰樂(lè)菌素在小柱上的保留，實(shí)驗(yàn)中選用洗脫能力極性由弱到強(qiáng)的甲醇和乙酸乙酯作為洗脫液，但其效果不佳，改換為堿性甲醇后回收效果很好。其可能原因是堿性環(huán)境破壞了泰樂(lè)菌素的配體結(jié)合形式，使其分子極性增強(qiáng)，在C18柱上的保留行為發(fā)生改變而容易被洗脫。與C18小柱相比HLB具有強(qiáng)吸附作用，但同時(shí)必須以更強(qiáng)洗脫強(qiáng)度的進(jìn)行洗脫，使用兩種SPE小柱的結(jié)果無(wú)明顯差別，因而選用了價(jià)格較低的Sep－Vac C18柱進(jìn)行試驗(yàn)。

4 結(jié)論

本文建立了一種超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法對(duì)豬血清中泰樂(lè)菌素進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)檢測(cè)指標(biāo)的考察，試驗(yàn)方法檢測(cè)限達(dá)到0.2 ng·mL－1，有較好的準(zhǔn)確度和精密度，方法回收率符合檢測(cè)要求。本方法樣品的提取和凈化操作簡(jiǎn)單，可以對(duì)血清中微量泰樂(lè)菌素進(jìn)行快速鑒別和測(cè)定。能夠建立一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效和嚴(yán)格的方法來(lái)檢測(cè)豬血清中的泰樂(lè)菌素殘留情況，并為藥物代謝動(dòng)力學(xué)提供了可靠的檢測(cè)方法。

[1] Blackwell P A,Holten，Lützh ft H C,et al.Ultrasonic extraction of veterinary antibiotics from soils and pig slurry with SPE clean－up and LC－UV and fluorescence detection[J].Talanta,2004,64(4):1058－1064.

[2] Leal C,Codony R,Compa ó R,et al.Determination of macrolide antibiotics by liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2001,910(2):285－90.

[3] 李俊鎖,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2002:413－458.

[4] Youn－Hwan Hwang,Jong－Hwan Lim,Park BK,etal.Simultaneous determination of various macrolides by liquid chromatography/mass spectrometry[J].Journal ofVeterinary Science,2002,1(2):103－108.

[5] Granja,R.Nino,A.Zucchetti.R.Determination of erythromycin and tylosin residues in honey by LC/MS/MS.[J].Journal of Aoac International,2009,92(3):975－980.

[6] Benetti C,Dainese N,Biancotto G,et al.Development and validation of a method to quantify and confirmtylosin residues in honey using liquid chromatography－tandem mass spectrometric detection.[J].Analytica Chimica Acta,2004,520(1):87－92.

[7] M.Herrera,H.Ding,R.McClanahan,etal.Quantitative determination of tilmicosin in canine serum by high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry[J].J Chromatography B,2007,857(1):9－14.

[8] 徐錦忠,吳宗賢,楊雯筌,等.液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蜂蜜中8種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留[J].分析化學(xué),2007,35(2):166－170.

[9] Dubois M,Fluchard D,Sior E,et al.Identification and quantification of five macrolide antibiotics in several tissues,eggs and milk by liquid chromatography－electrospray tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2001,753(2):189－202.

[10] Draisci R,Palleschi L,Ferretti E,et al.Confirmatory method for macrolide residues in bovine tissues by micro－liquid chromatography－tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2001,926(1):97－104.

[11] Codony R,Compano R,Granados M,et al.Residue analysis of macrolides in poultry muscle by liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry[J].Chromatogr A,2002,959(1－2):131－41.