王 新，崔一 ，邵 紅，韓鐵鎖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

中藥抗菌作用的研究是在中藥治療感染性疾病確有療效的基礎(chǔ)上進(jìn)行的[1]。由于抗生素的廣泛應(yīng)用，曾使中藥抗菌作用的研究不被醫(yī)學(xué)界所重視。但細(xì)菌耐藥性的普遍產(chǎn)生和日益被關(guān)注的藥物殘留問(wèn)題，為中藥抗菌作用的研究提供了契機(jī)。關(guān)于中藥抗菌作用的研究資料較多，其中單味中藥抗菌作用的研究資料明顯多于中藥復(fù)方[2]，這與中藥多是復(fù)方應(yīng)用的客觀現(xiàn)狀不符。加強(qiáng)中藥復(fù)方抗菌作用的研究才符合臨床應(yīng)用的需求。甲氧芐啶為化學(xué)合成的抗菌增效劑，對(duì)多種抗生素和中藥具有抗菌增效作用[3－4]。目前，關(guān)于甲氧芐啶對(duì)中藥抗菌增效作用的研究較少，且僅為定性研究。因此定量研究甲氧芐啶對(duì)中藥抗菌增效作用，為研發(fā)防治畜禽疾病的中西藥復(fù)方制劑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對(duì)有效地控制畜禽細(xì)菌性疾病和促進(jìn)中藥在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

沙門氏菌（CMCC50115）、大腸桿菌（ATCC35218）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）均購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)檢所。

1.1.2 藥物

甲氧芐啶購(gòu)于太原市康瑞寶獸藥制造有限公司，批號(hào)：20080503。黃芩、連翹、板藍(lán)根和蒲公英4味中藥購(gòu)于大慶市福瑞邦醫(yī)藥公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶液的制備

精確稱量128 mg的甲氧芐啶制成1 280 μg·mL－1的甲氧芐啶藥液100 mL。采用水提醇沉法制備含2 g·mL－1生藥的中藥提取液，將黃芩、板藍(lán)根、蒲公英和連翹的提取液按1∶1∶2∶1比例配伍組成中藥復(fù)方（含生藥量為625 mg·mL－1），流通蒸汽滅菌30 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化

采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌活化，將菌液稀釋至濁度為1×107cfu·mL－1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中藥復(fù)方和甲氧芐啶的體外抗菌試驗(yàn)

采用試管二倍稀釋法[5]測(cè)定甲氧芐啶及中藥復(fù)方對(duì)3種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.4 中藥復(fù)方與甲氧芐啶聯(lián)用體外抗菌增效試驗(yàn)

將中藥復(fù)方用無(wú)菌肉湯稀釋到2 MIC濃度，將甲氧芐啶藥液稀釋到640、320、160、80和40 μg·mL－1濃度。取7只已編號(hào)滅菌試管，1～5號(hào)管分別加入5種甲氧芐啶藥液1 mL和2 MIC的中藥復(fù)方1 mL，6號(hào)管中加入2 MIC的中藥復(fù)方和肉湯各1 mL，7號(hào)管為對(duì)照管加入肉湯2 mL；然后每個(gè)試管中加入2×106cfu·mL－1細(xì)菌懸液0.1 mL。充分搖勻后，4℃冰箱內(nèi)靜置。分別在1、2、4和8 h，采用平板計(jì)數(shù)的方法測(cè)定細(xì)菌數(shù)[6]，并計(jì)算殺菌率。其計(jì)算公式為：殺菌率（%）=（對(duì)照管菌落數(shù)－試驗(yàn)管菌落數(shù)）/對(duì)照管菌落數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件中ANOVA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方和甲氧芐啶的體外抗菌試驗(yàn)

從表1可知，甲氧芐啶對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抗菌活性較強(qiáng)，而中藥復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌活性較強(qiáng)，對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌相對(duì)較差。

表1 藥物對(duì)3種細(xì)菌的MIC值Table 1 MIC of drugs on three kinds of bacteria

2.2 中藥復(fù)方與甲氧芐啶聯(lián)用體外抗菌增效試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～4。從表中可知，當(dāng)甲氧芐啶添加劑量為 40 μg·mL－1時(shí)，表現(xiàn)出顯著的抗菌增效作用（P＜0.01），且隨著劑量的升高而增強(qiáng)。但甲氧芐啶的添加劑量為160與320 μg·mL－1兩組比較差異性不顯著（P＞0.05），表明甲氧芐啶的添加劑量與其對(duì)中藥復(fù)方抗菌增效作用之間的存在一定的線性關(guān)系，并不是TMP的添加劑量越大越好，而是存在一個(gè)最優(yōu)的添加劑量。此外，還發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶與中藥復(fù)方聯(lián)用的最佳添加量依據(jù)菌種的不同也存在較大的差異。利用最小二乘法對(duì)各表的1、2、4和8 h殺菌率進(jìn)行擬合，均符合一元二次方程y=ax2+bx+c，擬合度均達(dá)到0.95以上；然后依據(jù)公式y(tǒng)max=－b/2a計(jì)算甲氧芐啶添加的最優(yōu)值。計(jì)算出對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌甲氧芐啶添加的平均最優(yōu)值分別為224、244和252 μg·mL－1。將甲氧芐啶添加的平均值與中藥復(fù)方用量（金黃色葡萄球菌為78 mg·mL－1，大腸桿菌和沙門氏菌為156 mg·mL－1）進(jìn)行換算，得到甲氧芐啶對(duì)中藥復(fù)方體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌最優(yōu)添加劑量分別為2.9、1.6和1.6 mg·g－1。

表2 藥物聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

表2 藥物聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

注：同行間比較，不同字母間相比較差異顯著（P＜0.05），含相同字母者為差異不顯著（P＞0.05）；下同。Note:Comparison between the same line,different letters mean significant difference(P＜0.05)，same letter means insignificant difference(P＞0.05).The same as below.

時(shí)間（h）Time甲氧芐啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 45.06±1.24a 56.45±1.55a 65.88±2.15a 80.94±1.32a 1 2 4 8 48.88±1.56ba 59.93±1.64ba 68.68±2.00a 82.14±2.66ba 51.31±2.28b 63.08±2.60bc 74.88±1.52b 85.77±2.32b 56.02±1.59c 67.66±2.05cd 80.43±3.07c 90.16±2.05c 59.39±0.83cd 70.24±2.26d 84.06±3.74cd 92.98±2.52c 62.43±1.22d 71.28±2.14d 85.95±2.16d 93.30±1.59c

表3 藥物聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的殺菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

表3 藥物聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的殺菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

時(shí)間（h）Time甲氧芐啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 37.75±1.56a 51.54±0.80a 62.29±1.55a 74.10±1.19a 1 2 4 8 41.91±1.69a 53.86±1.61a 65.85±2.39a 76.22±1.86a 46.06±1.45b 60.01±1.50b 70.58±2.89b 81.04±1.55b 52.86±0.89c 65.95±1.59c 76.38±1.97c 85.81±1.13b 56.98±1.59cd 70.80±1.23d 82.92±1.41d 90.70±1.44c 59.19±1.22d 71.57±0.83d 85.04±1.47d 94.06±0.90c

表4 藥物聯(lián)用對(duì)沙門氏菌的殺菌率Table 4 Bactericidal rate of drug combination against Salmonella (X±S,%)

3 討論與結(jié)論

中藥復(fù)方中黃芩為君藥，以連翹、蒲公英為臣藥，板藍(lán)根清熱解毒，與黃芩、連翹相呼應(yīng)，共湊清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。試驗(yàn)結(jié)果表明,中藥復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值分別為78、156和156 mg·mL－1。而張丁華等自擬6種中藥復(fù)方對(duì)沙門氏菌的MIC為41.7～166.7 mg·mL－1，對(duì)大腸桿菌的 MIC 在 62.5～125 mg·mL－1之間[7]。盧芳國(guó)等報(bào)道 12種中藥復(fù)方對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均在62.5～125 mg·mL－1之間[8]?？咕钚缘牟町愐环矫媸桥c中藥復(fù)方的組成有關(guān)，另外也與細(xì)菌的毒力、接菌數(shù)量和試驗(yàn)方法等密切相關(guān)。

甲氧芐啶對(duì)中藥增效作用的報(bào)道多是定性研究[9－10]，而甲氧芐啶與中藥聯(lián)用時(shí)的最佳添加劑量的研究更具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)依據(jù)甲氧芐啶MIC值，設(shè)定了甲氧芐啶的系列添加劑量；采用了4℃靜置的方式使藥物作用于細(xì)菌，避免了37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌呈幾何基數(shù)增殖造成的用藥組與對(duì)照組之間的不可比性；再利用最小二乘法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明甲氧芐啶對(duì)中藥復(fù)方發(fā)揮了明顯的抗菌增效作用，并計(jì)算出甲氧芐啶對(duì)中藥復(fù)方體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌最優(yōu)添加劑量，由于中藥的體外抗菌機(jī)制尚未明確，所以二者聯(lián)用增效的機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。

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