劉 芳 ，房 青 ，關(guān) 劼 ★，李紅艷 ，徐 波

（1.中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科；2.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 病理生理室，北京 100029）

胃癌的發(fā)生發(fā)展是多階段、多步驟的過程，有多種因素參與。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胃癌可能是幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp） 長(zhǎng)期感染與其它因素共同作用的結(jié)果。端粒酶和p53的表達(dá)被認(rèn)為和大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，端粒酶已被認(rèn)為是胃癌臨床診斷的良好指標(biāo)。有關(guān)p53表達(dá)和Hp感染關(guān)系的研究不少，但研究結(jié)論不一致。本課題通過檢測(cè)胃癌前病變患者的胃粘膜組織中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA、p53 蛋 白 的 表 達(dá) 和Hp感染狀況，分析它們的相關(guān)性，旨在探討Hp感染對(duì)胃粘膜病變的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 樣品收集

對(duì)2004年～2006年間在我院就診的患者于2007年～2010年再次進(jìn)行胃鏡追蹤隨訪，均于胃竇處提取組織2塊，共隨訪60例，平均隨訪時(shí)間為2年。其中Hp根除者26例 （腸上皮化生16例，慢性淺表性胃炎10例），未根除者10例（腸上皮化生6例，慢性淺表性胃炎4例）；對(duì)照組為持續(xù)陰性者24例（腸上皮化生11例，慢性淺表性胃炎13例）。治療方案：①Hp根除方案：奧美拉唑（20mg，2 次 ／d）、阿莫西林克拉維酸鉀片（1.125g，2 次／d）、 克拉霉素 （0.5g，2 次 ／d）、 膠體果膠鉍（200mg，3/d），療程 10d，對(duì)青霉素過敏者將阿莫西林克拉維酸鉀替換為利復(fù)星 （0.2g，2次／d）；②對(duì)照組用胃粘膜保護(hù)劑治療。所有患者在首次胃鏡檢查前1個(gè)月內(nèi)均未接受抑酸或抗生素治療，在治療結(jié)束停藥1個(gè)月后復(fù)查胃鏡。

1.2 試劑

采用Warthin-Starry改良銀染法檢測(cè)胃粘膜組織中Hp感染，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析胃粘膜組織中端粒酶表達(dá)水平，所需Trizol試劑、SYBR Green ER試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司 。 靶 序 列 ：hTERTF：5'-Cgg，AAg，AgT，gTC，Tgg， AgC，AA-3'，hTERTR；5'-ggA，TgA，AgC，ggA， gTC，Tgg，A-3'。 內(nèi)對(duì)照物：β-actinF （5'－TCT ACG AGG GCT ATG CTC TCC-3'）；β-actinR（5'－GGA TGC CAC AGG ATT CCA TAC-3'）。

1.3 方法

1.3.1 Hp感染檢測(cè)

采用Warthin-Starry改良銀染法檢測(cè)胃粘膜組織中Hp感染情況，顯微鏡下見到典型的短棒狀或螺旋狀棕黑色顆粒判為Hp陽(yáng)性。根據(jù)銀染的數(shù)量，＜10%為陰性 （-），10%～50%為弱陽(yáng)性（+），50%～75%為中等陽(yáng)性（++），≥75% 為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3.2 端粒酶hTERT表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)胃粘膜組織中hTERT mRNA表達(dá)水平，用Trizol試劑按標(biāo)準(zhǔn)程序提取組織總RNA，將組織塊在研缽中加入液氮研磨成粉末，按50～100mg組織加入1ml Trizol試劑，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，加入 200μl氯仿，離心后吸取上層水相，異丙醇沉淀后，75%乙醇洗2次，用DEPC水溶解RNA沉淀。

用SYBR Green ER試劑盒中的逆轉(zhuǎn)錄酶將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取50ng cDNA加入PCR擴(kuò)增預(yù)混液中，在ABI 7700實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行hTERT定量分析，條件為95℃融解15s，60℃退火/延伸 45s，共 40 個(gè)循環(huán)。 以 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內(nèi)參照。

將hTERT與GAPDH拷貝數(shù)之比的100倍作 為 標(biāo) 準(zhǔn) 化 hTERT （normalizedhTERT，NhTERT），即：NhTERT=（hTERT/GAPDH）×100。

1.3.3 p53蛋白的檢測(cè)

免疫組化檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)采用鏈霉素親生物素——過氧化酶聯(lián)接法（SP法），常規(guī)固定、切片，染色，設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。選取具有適當(dāng)形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞用于評(píng)估。高倍鏡下選擇5個(gè)代表性視野計(jì)數(shù)，胞核呈棕黃色的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%判斷為陽(yáng)性，＜5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，多組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)和檢驗(yàn)，用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

Hp陽(yáng)性患者共36例，Hp陰性患者共24例。表1示，hTERT及p53蛋白的表達(dá)水平在Hp陽(yáng)性患者中顯著高于Hp陰性患者。

表2示，Hp根除者治療后hTERT與治療前相比顯著下降 （P＜0.05），Hp根除組 hTERT與對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05）；未根除者與對(duì)照組上述指標(biāo)均無顯著性差異（均P＞0.05）。

表1 治療后Hp陽(yáng)性和陰性組的hTERT mRNA表達(dá)水平

表2 Hp根除前后hTERT mRNA表達(dá)的變化

3 討論

端粒酶活性與惡性腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的活性，使細(xì)胞不能滅亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。

p53基因的變異和hTERT基因的激活在胃癌的增殖和惡化中起到關(guān)鍵的作用[2]。王國(guó)安等[3]研究顯示hTERT表達(dá)率在萎縮性胃炎、腸化生、異型增生和胃癌等不同粘膜癌變過程中呈遞增趨勢(shì)。Hp感染為胃癌的發(fā)病因素之一已得到共識(shí)，Hp具體的致癌機(jī)制目前仍不清楚。Hp感染與端粒酶活性之間的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)，Kashima等[4]在Hp感染與端粒酶活性關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，正常胃粘膜中無端粒酶活性表達(dá)，胃癌組織端粒酶活性明顯升高為83.3%；Hp陽(yáng)性組胃粘膜端粒酶活性為50.7%，明顯高于Hp陰性組17.2%（P＜0.01），根除 Hp 后端粒酶活性（40.0%，4/10）明顯低于根除治療前（90.0%，9/10）（P＜0.05），認(rèn)為Hp陽(yáng)性胃疾病端粒酶活性增強(qiáng)，根除Hp后端粒酶活性明顯低于根除治療前。本研究表明，Hp陽(yáng)性組hTERT表達(dá)明顯增高于Hp陰性組，提示端粒酶活性在胃癌前病變階段已經(jīng)發(fā)揮作用。朱亞杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的變化在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，p53突變可以影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活。本研究表明，Hp陽(yáng)性組p53蛋白表達(dá)明顯增高于Hp陰性組，隨著Hp的根除治療表達(dá)有明顯降低，提示p53蛋白與Hp感染有關(guān)系。國(guó)外已有研究對(duì)癌癥患者手術(shù)、化療或放療前后組織中和血漿中的hTERT mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，可指導(dǎo)診治及評(píng)估預(yù)后。利用hTERT基因進(jìn)行靶向性基因治療也是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6]。

Hu等[7]將胃粘膜腸上皮化生伴 Hp感染和腸上皮化生不伴Hp感染分2組，用Trap法測(cè)定其端粒酶活性，結(jié)果顯示腸上皮化生伴 Hp感染端粒酶活性高于不伴Hp感染的腸上皮化生，且有顯著性差異。本研究表明Hp陽(yáng)性組患者的端粒酶活性定量高于Hp陰性組，根除后明顯降低。提示Hp感染是胃粘膜上皮端粒酶激活的主要機(jī)制之一。Hp誘導(dǎo)的粘膜增殖可能涉及多個(gè)不同水平的調(diào)控環(huán)節(jié)。研究表明在胃癌演變的初始階段，Hp 可能導(dǎo)致 TNF、iNOS、CD95、Fas受體表達(dá)和capase活化，進(jìn)而增強(qiáng)P27蛋白表達(dá)，使Rb蛋白絲氨酸殘基磷酸化減少，細(xì)胞周期蛋白E相關(guān)CDK2激酶活性顯著降低，進(jìn)而細(xì)胞分化G1、S期被抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。Yan等[9]研究認(rèn)為在p53基因發(fā)生突變的細(xì)胞系MKN28中p53蛋白轉(zhuǎn)錄活性最低，進(jìn)一步提示p53突變可以影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，深入探討Hp與端粒酶及p53蛋白的關(guān)系及機(jī)制對(duì)胃癌的防治具有重要意義。

[1]黎銀燕，王云南，Cha Hong，等.檢測(cè)端粒酶及其亞基在肺癌診斷中的臨床價(jià)值[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2008，14（14）：5-8.

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[3]王國(guó)安，劉海峰，滕小春，等.人端粒酶催化亞單位和c-myc蛋白在胃癌及癌前病變中的表達(dá)及意義 [J].現(xiàn)代腫瘤學(xué)，2010，18（2）：327-328.

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