宋紅霞, 李秀婷, 孫寶國, 宋煥祿, 朱運(yùn)平

木聚糖是由β-1,4糖苷鍵相連的木糖基構(gòu)成主鏈的線性大分子.木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜常具有復(fù)雜的側(cè)鏈,它的完全降解需要多種水解酶的參與,其中β-1,4-內(nèi)切木聚糖(EC.3.2.1.8)以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量的木糖,是木聚糖降解中最關(guān)鍵的酶[1-2].木聚糖酶在食品、飼料、紙漿造紙、木質(zhì)纖維原料的生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值[1],引起了人們的廣泛關(guān)注.許多研究表明[3-5],富含木聚糖的木質(zhì)纖維原料可誘導(dǎo)木聚糖酶的產(chǎn)生.此類農(nóng)業(yè)廢棄物作誘導(dǎo)底物能夠有效地降低酶制劑的生產(chǎn)成本,由此產(chǎn)生的木聚糖酶十分適合于工業(yè)應(yīng)用.在資源日益匱乏的今天,利用廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)高附加值的木聚糖酶具有重要的實(shí)際意義.本文著重對微生物發(fā)酵木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)木聚糖酶的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述.

1　木質(zhì)纖維原料利用現(xiàn)狀

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品加工過程產(chǎn)生大量木質(zhì)纖維類農(nóng)業(yè)廢棄物,主要包括農(nóng)作物秸桿、谷殼、果殼及甘蔗渣、醪渣等農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物.這些農(nóng)作物廢棄物占農(nóng)田生物質(zhì)總產(chǎn)量的50%以上[6],產(chǎn)量非常巨大.2003年我國農(nóng)作物秸稈的總產(chǎn)量約6.5×108t,其中稻草、玉米秸稈總量達(dá)到了4.5×108t[7].目前,我國農(nóng)業(yè)廢棄物的利用方式比較粗放,主要是作為燃料和飼料,還有一部分被直接還田,大約2/3的農(nóng)作物秸稈被燃燒、拋棄或閑置,木質(zhì)纖維原料的利用效率低下.農(nóng)作物秸稈直接作為燃料燃燒時熱效能僅為10%[8],造成了巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染;木質(zhì)纖維原料作為飼料普遍存在飼用率低的問題;農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展導(dǎo)致化肥的大量施用,農(nóng)業(yè)廢棄物還田技術(shù)也被人們所忽視[6-9].我國木質(zhì)纖維原料資源化率低,最根本的原因是對木質(zhì)纖維原料的認(rèn)識不足.

木質(zhì)纖維原料的主要化學(xué)成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,除此之外,還可能含有少量的果膠、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素等成分.纖維素是自然界中含量最豐富的多糖,在植物細(xì)胞壁中纖維素聚集成微纖維[10].半纖維素是指植物細(xì)胞壁除去果膠物質(zhì)后的殘留物能被15%氫氧化鈉所提取的堿溶性多糖[10].木聚糖是半纖維素的主要成分,在被子植物中占干重的20% ～30%,在農(nóng)作物中約占25%～45%[10].木質(zhì)素則是一種復(fù)雜的不溶性酚類聚合物,它具有抗化學(xué)、真菌、細(xì)菌攻擊能力強(qiáng)的特點(diǎn).在植物細(xì)胞壁中,微纖維包埋于半纖維素、木質(zhì)素組成的基質(zhì)中,形成了一種致密的結(jié)構(gòu)[1][10](見圖1):半纖維素位于微纖維和木質(zhì)素之間,半纖維素以非化學(xué)鍵與纖維素相作用,并以共價鍵與木質(zhì)素相連.木質(zhì)纖維的這種致密的結(jié)構(gòu)對于維持原位纖維的結(jié)構(gòu)完整性有重要作用,同時增強(qiáng)了植物纖維對木質(zhì)纖維降解酶的抵抗能力.農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維原料是寶貴的可再生資源,其綜合利用主要有5個方向[7-9]:能源化、肥料化、飼料化、材料化和基質(zhì)化.其中基質(zhì)化是指以農(nóng)業(yè)廢棄物為發(fā)酵底物,進(jìn)行食用菌培養(yǎng)或微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑等高附加值產(chǎn)品.利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)木聚糖酶的報道很多,麩皮[11]、麥稈[12]、玉米芯[13]、玉米秸[14]、稻稈[15]、稻殼[16]、高粱桿[17]、甘蔗渣[18]是常見的木聚糖酶誘導(dǎo)物,橘皮[19]、酒糟[20]、葡萄渣[21]等農(nóng)業(yè)加工廢棄物以及非飼料型雜草[4]等也可以誘導(dǎo)微生物產(chǎn)木聚糖酶.

2　微生物木聚糖酶的產(chǎn)生

圖1　木質(zhì)纖維的組成示意Fig.1　Woodfiber composition

微生物木聚糖酶多為誘導(dǎo)酶,多種木聚糖是良好的誘導(dǎo)物,除此之外,木寡糖、木糖和木質(zhì)纖維素殘基也是常見的誘導(dǎo)物,但誘導(dǎo)效果多樣[22].隨著國內(nèi)外對木聚糖酶的研究的深入,許多能利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)木聚糖酶的微生物得到了分離,主要生產(chǎn)菌是嗜熱棉毛菌[13][17]、木霉[23]、曲霉[19]、青霉[12][20]、鏈霉菌[16]和芽孢桿菌[11].目前誘導(dǎo)微生物產(chǎn)木聚糖酶的機(jī)制尚未完全明了.Kulkarni[24]描述了木聚糖誘導(dǎo)微生物細(xì)胞產(chǎn)木聚糖酶的過程:木聚糖是一種大分子聚合物,不能直接穿過細(xì)胞壁,只有降解為小分子片段后才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而誘導(dǎo)木聚糖酶產(chǎn)生.在微生物生長過程中,首先分泌出少量組成型木聚糖酶,作用于細(xì)胞外的木聚糖產(chǎn)生長度不一的低聚木糖,然后這些低聚木糖在細(xì)胞透過酶的作用下進(jìn)入細(xì)胞,誘導(dǎo)木聚糖酶基因開始合成并分泌一些木聚糖降解酶到細(xì)胞外.這些酶主要包括:內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、轉(zhuǎn)糖苷酶,它們一方面繼續(xù)降解木聚糖產(chǎn)生低聚木糖,另一方面降解低聚木糖為二糖.而這些二糖經(jīng)細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移酶作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生第二階段的木聚糖酶.

表1　幾種農(nóng)業(yè)廢棄物的成分分析Tab.1　Analysis of components of several agricultural wastes

相對于純木聚糖而言,農(nóng)業(yè)廢棄物誘導(dǎo)產(chǎn)酶的過程更為復(fù)雜,具體的機(jī)理尚不清楚.許多研究表明,麩皮能夠誘導(dǎo)多種微生物產(chǎn)生大量的木聚糖酶[11][30-31],而稻殼[32]、甘蔗渣[33]的誘導(dǎo)效果則相對較差.麩皮的化學(xué)成分分析(見表1)表明麩皮中含10% ～14%的可溶性糖,其中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖分別占42.5%,15.4%,3.1%和2.7%,在發(fā)酵前期這些糖分促進(jìn)了微生物生長和增殖[30],另外這些單糖本身也可能具有誘導(dǎo)作用[22];麩皮含有36%的半纖維素和超過10%的粗蛋白氮,大量木聚糖的存在充分地誘導(dǎo)了木聚糖酶的產(chǎn)生,而有機(jī)氮對木聚糖酶蛋白的形成具有重要的作用[30][34].同時由于麩皮中的木質(zhì)素含量低,麩皮表面結(jié)構(gòu)比較疏松,有利于營養(yǎng)成分的釋放以及木聚糖酶與底物的接觸.稻殼和甘蔗渣中的半纖維素含量小于20%,木質(zhì)化程度較高(見表1),木質(zhì)纖維表面比較致密,不利于微生物對木聚糖的利用,這可能是其誘導(dǎo)效果差的原因[30].將較難利用的農(nóng)業(yè)廢棄物與麩皮復(fù)合,來誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶,因各種營養(yǎng)成分發(fā)揮了協(xié)同作用,也會進(jìn)一步提高產(chǎn)酶能力.A.oryzae FS018[35]可以利用多種農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)生木聚糖酶,當(dāng)用麩皮與玉米芯進(jìn)行復(fù)合時,產(chǎn)酶水平明顯高于單一碳源.麩皮中纖維素、木素含量低,質(zhì)地較軟,木聚糖酶與半纖維素的可能較易接近,同時麩皮營養(yǎng)豐富,易被菌體利用.玉米芯中半纖維素含量較高,其中大量的木聚糖能對菌株產(chǎn)酶起到良好的誘導(dǎo)作用,但由于玉米芯質(zhì)地較硬,有效成分可能不易被菌體利用.當(dāng)選用復(fù)合碳源時營養(yǎng)豐富的麩皮作為主要碳源,促進(jìn)菌體生長,而玉米芯中豐富的木聚糖,可在菌體生長旺盛的條件下誘導(dǎo)木聚糖酶的大量產(chǎn)生[35].

根據(jù)上述分析，現(xiàn)階段分布式儲能項(xiàng)目的經(jīng)濟(jì)性主要影響因素包括：項(xiàng)目投資成本、當(dāng)?shù)胤骞入妰r差、峰谷平時段、電池壽命、儲能充放電方式、企業(yè)用電量、生產(chǎn)運(yùn)行狀況和電池梯級利用及回收成本等。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，廣東省、江蘇省、上海市等峰谷電價差較大的地區(qū)（一般電價差大于0.75元/kWh），儲能項(xiàng)目已具有經(jīng)濟(jì)性，部分地區(qū)已建設(shè)較大規(guī)模的儲能示范項(xiàng)目[6]。

不同木質(zhì)纖維原料的誘導(dǎo)效果差異很大,引起這種差異的原因可能是:1)不同誘導(dǎo)底物中木聚糖的組成結(jié)構(gòu)差異性,例如麩皮木聚糖的阿拉伯取代基較多[26],可能影響了酶與底物的識別及結(jié)合[1].2)農(nóng)業(yè)廢棄物成分復(fù)雜,存在的其他的營養(yǎng)成分如可溶性糖可能對木聚糖酶的產(chǎn)生具有促進(jìn)或抑制作用[22].3)不同農(nóng)業(yè)廢棄物顆粒的表面性質(zhì)、致密程度不同,木聚糖酶與木聚糖接觸以及營養(yǎng)成分的釋放難易程度不同[30].4)木質(zhì)纖維的降解、木聚糖的暴露需要多種酶的參與,微生物所產(chǎn)生的降解酶系可能存在差異.對同一種微生物來說,不同底物的可降解性能也有所不同.

3　利用木質(zhì)纖維素原料所產(chǎn)木聚糖酶的概況

微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖主要采用兩種方式:固體發(fā)酵和液體發(fā)酵.液體深層發(fā)酵是一項(xiàng)成熟的技術(shù),可以精確地控制通氣、pH、溫度等參數(shù),方便地進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.采用搖瓶發(fā)酵、小型發(fā)酵罐發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)木聚糖酶的報道非常多[4][11][16][20][36].許多研究發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵的放大比較困難,從250 mL搖瓶培養(yǎng)放大至5 L發(fā)酵罐,Kumar等[36]發(fā)現(xiàn)Thermomyces lanuginosus MC 134的產(chǎn)酶量由3 299 U/mL降至2 009 U/mL.木聚糖酶生產(chǎn)從實(shí)驗(yàn)室水平到實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)需大量的投入.固體發(fā)酵是一種環(huán)境友好、低成本的發(fā)酵技術(shù).微生物在潮濕的幾乎沒有自由水的培養(yǎng)基上生長代謝,因此固體發(fā)酵方式更接近微生物自然生長環(huán)境,是生產(chǎn)酶類和次級代謝物包括木聚糖酶的有效方法[12][30].富含木聚糖酶的廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物非常適合作為固體發(fā)酵的底物生產(chǎn)木聚糖酶,固體發(fā)酵方式在絲狀真菌中更為常見.絲狀真菌能在水分含量較低條件下生長,其菌絲能攀附在木質(zhì)纖維原料表面生長,并滲透到基質(zhì)內(nèi),與其他單細(xì)胞的細(xì)菌及酵母菌相比,更適合固體發(fā)酵.以棕櫚纖維為固體發(fā)酵底物,土曲霉A.terreus MTCC 8661[37]分泌了高達(dá)115 000 U/gds的胞外木聚糖酶.引人注意的是,近來報道了兩種細(xì)菌 B.pumilus[30]、Burkholderia sp.[38],它們固體發(fā)酵麩皮產(chǎn)木聚糖酶水平分別達(dá)到了25 431 U/gds和5 200～5 600 U/gds.但是固體發(fā)酵具有傳熱傳質(zhì)不均勻,發(fā)酵參數(shù)不容易控制,不容易機(jī)械化操作等缺點(diǎn),限制了其大規(guī)模的應(yīng)用[3].

微生物誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的機(jī)理尚不明確,Dwivedi認(rèn)為誘導(dǎo)底物木聚糖的高度不均一性是產(chǎn)生同工酶的誘因[4].Chandra R的研究發(fā)現(xiàn),Aspergillus fumigatus AR1在酸性條件下利用木聚糖誘導(dǎo)時僅產(chǎn)生一種木聚糖酶,在堿性條件木糖誘導(dǎo)時則產(chǎn)生了至少四條木聚糖酶帶[39].不同的誘導(dǎo)底物以及培養(yǎng)條件都可能對不同種類木聚糖酶的合成發(fā)揮作用.木聚糖酶同工酶可能是由不同的基因翻譯而來[40],也可能是同一個基因的不同等位基因翻譯的產(chǎn)物[41];m-RNA前加工、蛋白多肽翻譯后加工等也可能導(dǎo)致同工酶的出現(xiàn)[42].這些同工酶的性質(zhì)比較相似,而這種復(fù)雜的木聚糖酶酶系,增加了木聚糖酶的純化難度.農(nóng)業(yè)廢棄物誘導(dǎo)木聚糖酶時經(jīng)常伴隨其他木質(zhì)纖維降解酶類的產(chǎn)生,在真菌中尤為明顯,例如 A.fumigatus fresenius[15]、A.oryzae 3.042[43]所產(chǎn)纖維素酶相對酶活均超過木聚糖酶的10%,過高的纖維素酶限制了木聚糖酶在紙漿生物助漂中的應(yīng)用,并增加了純化難度.關(guān)于酵母及大型食用真菌產(chǎn)木聚糖酶的研究也有報道[3][18],此類微生物安全性方面具有優(yōu)勢,但總體來說這種來源的木聚糖酶產(chǎn)量一般較低.

農(nóng)業(yè)廢棄物誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生木聚糖酶的現(xiàn)象比較普遍,總體而言,真菌產(chǎn)酶水平相對較高.以高粱桿和玉米芯分別誘導(dǎo) Thermomyces lanuginosus D2W3[17]和 Aspergillus foetidus MTCC 4898[44]進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶水平分別達(dá)到了48 000 U/gds和3 065 U/gds.嗜熱棉毛菌Thermomyces lanuginosus是一種高產(chǎn)木聚糖酶的嗜熱絲狀真菌,玉米芯能夠誘導(dǎo)Thermomyces lanuginosus SSBP[13]、 Thermomyces lanuginosus MC 134[36]和Thermomyces lanuginosus SDYKY-1[45]產(chǎn)生超過3 000 U/mL的木聚糖酶.嗜熱擬青霉Paecilomyces themophila J18以5.0%的玉米芯粉為碳源和誘導(dǎo)底物,發(fā)酵5天后產(chǎn)酶水平達(dá)到了1 276 U/mL[46].以麥稈為誘導(dǎo)底物進(jìn)行固體發(fā)酵Paecilomycesthemophila J18[12]產(chǎn)生了18 580 U/gds的木聚糖酶.Thermomyces lanuginosus SDYKY-1和Paecilomyces themophila J18是國內(nèi)利用木質(zhì)纖維原料發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的高產(chǎn)菌.真菌木聚糖酶的最適pH一般在5.0～7.0,分子量多在21 KDa～25 KDa之間[19][47-48],少數(shù)微生物能釋放高分子量的木聚糖酶[4][39][49].大多數(shù)真菌木聚糖酶的耐熱性能一般,耐熱性能好的木聚糖酶僅見于Thermomyces lanuginosus[13][50]、Paecilomyces themophila[51]、Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]木聚糖酶.Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH為9.0,在pH10.0,70℃保溫2小時相對酶活力超過60%,這在真菌木聚糖酶中是比較少見的.酶譜分析表明該菌株共產(chǎn)生121 KDa,77 KDa兩種分子量的木聚糖酶.許多微生物能同時產(chǎn)生兩種或兩種以上的木聚糖酶,例如Aspergillus fumigatus AR1[39]、Streptomyces actuosus A-151[16]等.

細(xì)菌木聚糖酶主要來源于芽孢桿菌.許多芽孢桿菌木聚糖酶在耐堿、耐高溫方面具有優(yōu)勢,但大多數(shù)芽孢桿菌產(chǎn)酶量較低[3],不能滿足實(shí)際應(yīng)用.近年來一些高產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌得到了分離:Bacillus pumilus MK001[11]和Bacillus pumilus ASH[52]分別以麩皮為誘導(dǎo)底物,液體發(fā)酵產(chǎn)酶水平高達(dá)2 886 U/mL和5 407 U/mL;而Asha P[30]等篩選到一株堿性耐熱短小芽孢桿菌,該菌株以麩皮為發(fā)酵底物,采用固體發(fā)酵的方式產(chǎn)生了25 431 U/gds的胞外木聚糖酶.短小芽孢桿菌Bacillus pumilus A-30在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵3天產(chǎn)酶水平為400 U/mL[53].多數(shù)芽孢桿菌木聚糖酶的最適pH在6.0～9.0之間,最適溫度在55～80℃,并且這些細(xì)菌很少產(chǎn)生纖維素酶[38][52-53],因此這些酶在紙漿造紙領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景.農(nóng)業(yè)廢棄物誘導(dǎo)放線菌產(chǎn)木聚糖酶的報道則相對較少,僅見于鏈霉菌.Streptomyces cyaneus SN32[54]和Streptomyces olivaceoviridis E-86[55]是已報道的可利用農(nóng)業(yè)廢棄物的木聚糖酶高產(chǎn)菌:產(chǎn)酶水平分別達(dá)716 U/mL和1 385 U/mL.放線菌所產(chǎn)木聚糖酶一般不伴隨產(chǎn)生纖維素酶,分子量集中在20～25 kDa或30～55 kDa;鏈霉菌木聚糖酶的最適pH值和pH值穩(wěn)定性分別為pH 5.5～7.0和pH 5.0～9.0之間,最適溫度和溫度穩(wěn)定性分別集中于65～80℃和50～70℃[16][54-55].與真菌木聚糖酶相比,鏈霉菌木聚糖酶在耐熱和耐堿性上具有一定的優(yōu)勢.

獲得一株出發(fā)菌株后,可以通過人工誘變、優(yōu)化發(fā)酵條件提高產(chǎn)酶能力.雖然誘變后的菌株存在回復(fù)突變的問題,仍有不少研究者通過人工誘變提高了微生物的產(chǎn)木聚糖酶能力,例如 Thermomyces lanuginosus SK[36]和 Penicillium oxalicum SA-8ITCC6024[4]經(jīng)物理化學(xué)誘變后產(chǎn)酶能力分別提高了1.5和1.87倍.

4　利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)木聚糖酶存在的問題及展望

木聚糖酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用需滿足生產(chǎn)成本低、催化活性高、對pH和溫度的穩(wěn)定性好、貯存穩(wěn)定等要求.雖然對木聚糖酶的研究越來越深入,但目前多數(shù)木聚糖酶的研究及應(yīng)用僅存在于實(shí)驗(yàn)室水平,僅有少數(shù)木聚糖酶的生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化.其主要原因是:多數(shù)微生物所產(chǎn)的木聚糖酶產(chǎn)量較低,不能滿足實(shí)際應(yīng)用;微生物利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)酶的機(jī)制尚未明了,微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的放大比較困難;農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵后的粗酶液中,除了木聚糖酶外還含有其他的酶類甚至是毒素,導(dǎo)致在很多領(lǐng)域直接使用粗酶液無法實(shí)現(xiàn),而后續(xù)的木聚糖酶的純化成本太高;目前多數(shù)木聚糖酶在耐酸、耐堿、耐高溫方面性能不足;國內(nèi)多數(shù)研究工作僅著眼于木聚糖酶的產(chǎn)量,對木聚糖酶的特性未能深入研究,木聚糖酶應(yīng)用特點(diǎn)的探討也不夠深入.

目前已商業(yè)化木聚糖酶的數(shù)量不多[3],并且這些酶的最適的作用溫度和pH還難以滿足實(shí)際生產(chǎn)中對不同特性木聚糖酶的需要.我國擁有豐富的廉價木質(zhì)纖維原料,直接利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)酶,將大大節(jié)省木聚糖酶的生產(chǎn)成本,用農(nóng)業(yè)廢棄物代替木聚糖作為木聚糖酶的誘導(dǎo)底物是大勢所趨.性能優(yōu)良的木聚糖酶生產(chǎn)菌是木聚糖酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ),因此今后的研究應(yīng)加強(qiáng)可利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)木聚糖酶的菌種篩選和酶應(yīng)用特點(diǎn)的探討.我國的微生物資源十分豐富,結(jié)合實(shí)際應(yīng)用的需求篩選低成本的不同特性的木聚糖酶生產(chǎn)菌株,深入研究其產(chǎn)酶的機(jī)理和過程,為木聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用提供菌種基礎(chǔ)及理論數(shù)據(jù),更好地控制微生物產(chǎn)酶及擴(kuò)大生產(chǎn)過程,使木聚糖酶在我國各個應(yīng)用領(lǐng)域均能發(fā)揮巨大作用.