陳 瓊, 陸瑞瓊

花青素(anthocyanidin)及其糖苷(anthocyanins)是植物中一大類次級代謝產物,是使植物花朵、果實呈現五彩繽紛顏色的主要水溶性色素,涉及27個科,73個屬的數萬種植物,分布極為廣泛.花青素的結構以C6-C3-C6為基本骨架,見圖1[1].目前在植物體內發(fā)現的花青素有22種,食品中主要有6種,自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見,其A環(huán)3-,5-,7-碳位上的羥基以糖苷鍵與糖結合形成花色苷,與花青素結合的糖種類、數量、結合位置不同,花色苷的種類則不相同[2].

圖1　花色苷母核結構Fig.1　Mother nucleus structure of anthocyanins

在自然界的茶樹中,常見有部分紅紫色芽葉的茶樹品種或單株,在高海拔、強光照、夏秋季茶園中,茶樹紫芽的發(fā)生率較高.花色苷是茶樹紫色芽葉的主要特征內含成分,含量遠高于綠色芽葉[3].在傳統(tǒng)的綠、紅等茶葉加工過程中,紫色芽葉由于其滋味苦澀、色澤深暗、花雜等不良品質特征而被剔除.然而,隨著多種富含花色苷的天然植物的研究揭示了花色苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抵抗胰島素調節(jié)等的特殊功能活性后,茶葉紫色芽葉的研究開始受到關注.

植物中花色苷單體的準確定量受到花色苷分離純度的限制,并需要單體標準品作為對照,目前的研究多將花色苷作為一個整體測定其總含量.定量方法根據其光學特性,用紫外 可見分光光度法進行分析,有單一pH法、pH示差法、差減法等.近年來,國外文獻中一般用pH示差法分析花色苷含量[4-5].對于茶樹芽葉中花色苷的含量測定,目前沒有國家標準,而沿用單一pH法進行測定[6].本研究采用單一pH法、pH示差法來測定茶樹紫色芽葉的花色苷含量,比較茶樹芽葉花色苷含量測定的方法,可為茶樹紫色芽葉的開發(fā)研究提供基礎.

1　方法原理

1.1　單一p H法

植物花色苷的最大吸收波長一般在500～540 nm,而茶樹芽葉花色苷的最大吸收波長在520～540 nm.單一pH值法測定花色苷含量需要在一個恒定的pH介質中進行,由于花色苷單體之間差別很小且比例未知,一般用平均比消光度(ε)來測定花色苷總量.茶葉花色苷消光系數按照文獻[6]提供數據,為101.83.

1.2　p H示差法[4-5]

pH示差法的依據是花色苷發(fā)色基團的結構轉換是pH值的函數,且干擾物質的吸收特性不隨pH值變化.pH值為1時,花色苷以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在,pH值為4.5時,花色苷以無色的甲醇假堿的形式存在.通過確定兩個對花色苷吸光度差別最大,但是對花色苷穩(wěn)定的pH值(一般選擇pH值為1.0和pH值為4.5),在最大吸收波長為700 nm處,花色苷溶液的吸光度差值與花色苷的含量成比例,根據 Fuleki公式可以計算花色苷總量[7].

2　實驗部分

2.1　儀器與試劑

UV1200型紫外可見分光光度計,HITACHI公司;FE-20型pH計,梅特勒 托利多公司;HH-6型電子恒溫水浴鍋,國華電器有限公司.

pH值為1.0緩沖溶液(0.2 mol/L KCl:0.2 mol/L HCl:H2O 為 50∶97∶53(v∶v∶v));

pH值為4.5緩沖溶液(準確稱取19.294 g NaAC加入24 mL冰醋酸中,定容至500 mL);

酸性乙醇溶液:85 mL無水乙醇加15 mL 1.5 mol/L鹽酸混勻.

2.2　樣品

茶葉來源,廣東省龍門縣南昆山采集茶樹紫芽1芽2葉,蒸青、烘干、磨碎、過篩供試驗用.

2.3　紫芽茶花色苷含量測定方法

紫芽茶理化測定制樣方法參考文獻[6]:準確稱取1.0 g紫芽茶磨碎干樣,加沸水40 mL,在沸水浴中提取30 min,過濾.濾液加水定容至50 mL為供試液.

單一pH法:取2～4 mL供試液于刻度試管中,用酸性乙醇定容至10 mL,搖勻立即顯出剛果紅色,平衡30 min,如發(fā)現有絮狀沉淀,可離心棄去沉淀物(2 000～2 500 r/mim,離心5 min),澄清的紅色溶液在最大吸收波長下測吸光值,以酸性乙醇為空白對照,計算花色苷含量[6].重復試驗3次.花色苷質量分數(mg/g) =

pH示差法:取5 mL上述供試液,分別用pH值為1.0和pH值為4.5的緩沖溶液定容至10 mL.待平衡后在最大吸收波長下測吸光值,計算花色苷含量.重復試驗3次.當樣品花色苷單體成分未知時,一般用在植物中最為普遍的花色苷矢車菊-3-葡萄糖苷作為標準物[8].

花色苷質量分數=

(A/εL) ×MW×DF ×V/Wt×100.

式中 A——吸光值;L——光程,1 cm;

ε——矢車菊-3-葡萄 糖苷的消 光 系 數,26 900;

MW——矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量,449.2;

DF——稀釋因子;

V——最終體積,mL;

Wt——產品質量,mg;

A=(A535pH1.0-A700pH1.0)-(A535pH4.5-A700pH4.5).

2.4　數據分析

實驗數據以x±s表示,用 SPSS Statistics 17.0軟件進行均值顯著性差異分析.

3　結果與分析

3.1　最大吸收波長的確定

一般花色苷特征吸收波長在520～540 nm,將pH值為1.0的花色苷待測液在500～700 nm波長范圍內進行可見光掃描,結果見圖2,確定茶樹紫芽花色苷最大吸收波長為530 nm.

圖2　紫芽茶花青素的可見光譜Fig.2　Visible absorption spectrum of anthocyanins from purple tea leaves

3.2　平衡時間的確定

對pH值為1.0和pH值為4.5花色苷待測液在530 nm處進行可見光掃描,結果見圖3、圖4.根據時間 吸光值曲線確定平衡時間.花色苷在pH值為1.0的緩沖溶液中,隨著時間延長,吸光值緩慢上升,在65 min后基本穩(wěn)定(A值變化＜1%).花色苷在pH值為4.5的緩沖溶液中,隨著時間延長吸光值變化不大.

因此,確定平衡時間為65 min.

圖3　pH值為1.0時花色苷吸光值隨時間變化光譜掃描圖Fig.3　Visible absorption spectrum of anthocyanins at pH 1.0

圖4　pH值為4.5時花色苷吸光值隨時間變化光譜掃描圖Fig.4　Visible absorption spectrum of anthocyanins at pH 4.5

3.3　花色苷含量的測定

對于5株茶樹紫芽茶芽葉,分別用單一pH法和pH示差法測花色苷含量,結果見表1.

表1　單一pH法和pH示差法測紫芽茶花色苷含量結果Tab.1　Determination of anthocyanins content by single-pH method and pH-differential spectrophotometry

單一pH法與pH示差法對紫芽茶花色苷含量測定存在顯著差異(P＜0.05),對于同一單株,單一pH法所測花色苷含量較pH示差法高5倍多.不同單株之間花色苷含量存在顯著差異(P＜0.05).

3.4　單一pH法與pH示差法測花色苷含量的相關性分析

對單一pH法與pH示差法測花色苷含量的相關性分析顯示,兩種方法之間具有良好的線性關系,回歸方程y=0.129 8x+0.000 3,R2=0.992 7(見圖5).

4　結 論

對5株紫芽茶單株采用單一pH法和pH示差法測定花色苷含量,結果表明,單一pH法所測結果均高于pH示差法,兩者存在良好線性關系.

圖5　單一pH法和pH示差法測紫芽茶花色苷相關性分析Fig.5　Correlation analysis between single-pH method and pH-differential spectrophotometry on determination of anthocyanins content

單一pH法測定花色苷的波長為530 nm,而類黃酮的吸收波長為350～380 nm,因此,本法不受黃酮苷、兒茶素的干擾.但受到茶葉中花白素的影響,花白素在酸性條件下會降解為花色苷,使實驗結果比實際值增大.pH示差法可以避免干擾物質因具有與花色苷相同的能量吸收范圍而造成含量的影響.但受兩個不同pH值下兩種花色苷存在形態(tài)的平衡轉化率的影響,花色苷測量值會略低于實際值.

高效液相色譜技術雖能準確地測定花色苷單體含量,但要對樣品花色苷進行分離純化,并需要花色苷單體標準品,而花色苷標準品的不穩(wěn)定,或是不明確樣品中的花色苷單體組成,該方法的使用則受到限制.

綜上所述,本研究采用的pH示差法測定茶葉鮮葉樣品中的花色苷總含量,能消除干擾物質對測定結果的影響,便于與其他來源植物花色苷含量的比較,可為茶樹芽葉的花色苷定量分析提供依據.