鹿寒冰 董瑞國(guó) 李曉賓 朱士光 郭 靖 趙 輝 莊麗麗 安曉雷 李傳玲

腦水腫是腦梗死后重要的繼發(fā)性病理改變，與梗死的預(yù)后密切相關(guān)，水通道蛋白（AQP）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)的主要膜蛋白，而腦組織中的水通道蛋白主要為AQP4，可能與腦水腫的形成密切相關(guān)。MRI對(duì)腦組織含水量的變化特別敏感，腦組織含水量的增加導(dǎo)致T1和T 2弛豫時(shí)間延長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)T1和T2信號(hào)強(qiáng)度值的測(cè)定，可以對(duì)腦組織含水量作定量分析［1］。本研究采用MRI的T1，T2，F(xiàn)LAIR，DWI序列相關(guān)指標(biāo)定量分析大鼠實(shí)驗(yàn)性腦梗死后腦水腫的動(dòng)態(tài)變化，并與AQP4的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討AQP4在腦梗死后腦水腫發(fā)生、發(fā)展和演變過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 選用健康成年清潔級(jí)SD雄性大鼠45只，體質(zhì)量240～300g（由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2005－0005）。

1.2 動(dòng)物及分組 大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組15只、腦梗死組30只，兩組大鼠又各分為6h、1、3、5、7d五個(gè)亞組。

1.3 試劑與儀器 一抗（兔來(lái)源AQP4多克隆抗體）為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品；二抗（二步法免疫組化試劑盒）由北京中山公司提供；生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)為德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品。

1.4 模型制作 采用改良的Zea Longa線栓法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，小心游離右頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用直徑為0.24 mm標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)線頭端浸蠟5 mm后插入CCA，隨后將線栓插入ICA，調(diào)整魚(yú)線方向使其避開(kāi)翼腭動(dòng)脈進(jìn)入ICA顱內(nèi)段，插入深度約定18～20 mm，遇阻力后即停止，造成局灶性腦梗死，在ICA根部結(jié)扎，假手術(shù)組為頸內(nèi)動(dòng)脈不插魚(yú)線，余操作同前。

1.5 試驗(yàn)陽(yáng)性大鼠選擇 腦梗死大鼠模型制作成功，待動(dòng)物清醒后按Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0分，無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。其中，0分及4分者被剔除，凡手術(shù)中大鼠死亡、蛛網(wǎng)膜下腔出血或無(wú)honer氏征者剔除，用來(lái)自同一批次的大鼠制成模型后補(bǔ)足數(shù)目。假手術(shù)組大鼠無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損，均入組。

1.6 MRI掃描 采用GE Signa 3.0T超導(dǎo) MRI成像設(shè)備，專用動(dòng)物線圈為接收線圈。大鼠俯臥位，頭置于線圈中央，自主呼吸。TIWI（IR FSE序列）：TR＝2195ms、TE＝15ms；T2WI（FSE序列）：TR＝2600ms、TE＝124ms；FLAIR （IR－FSE序列）成像：TR＝8000、TE＝133ms、TI＝2250ms；DWI（EPI序列）：TR＝2275ms，TE＝101ms，b值分別為0、1000s／mm2，冠狀面掃描，各序列采集8層，層厚2mm，間距0.2mm，矩陣256×192，F(xiàn)OV：6 cm×5 cm。兩組大鼠于造模后6 h、1、3、5、7 d行 MRI掃描

1.6.1 梗死體積測(cè)定 通過(guò)MRI機(jī)上的功能鍵自動(dòng)測(cè)量各層感興趣區(qū)（reigion of instrest，ROI）即梗死區(qū)面積，其中梗死6 h時(shí)在DWI序列上測(cè)量，其它時(shí)間點(diǎn)在FLAIR序列上測(cè)量，按公式［2］：梗死體積＝各層面積之和×（層厚＋層間距）－首尾兩層面積之和×1／2層間距。

1.6.2 T1WI、T2WI、FLAIR、DWI序列SIR的測(cè)定 各序列分別通過(guò)MRI機(jī)上的功能鍵自動(dòng)測(cè)量各層梗死區(qū)的平均信號(hào)強(qiáng)度值（signal intensity，SI），并同時(shí)測(cè)量對(duì)側(cè)相應(yīng)區(qū)域的SI，得出兩側(cè)半球各層感興趣區(qū)的平均SI值（即各層感興趣區(qū)的SI值之和除以層數(shù)），繼而算出信號(hào)強(qiáng)度比SIR（即病灶側(cè)平均SI／對(duì)側(cè)平均SI），來(lái)反應(yīng)腦梗死的相對(duì)含水量。假手術(shù)組在與梗死組相對(duì)應(yīng)層面隨機(jī)取感興趣區(qū)，測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度值，除以對(duì)側(cè)相應(yīng)區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度值，得出信號(hào)強(qiáng)度比。

1.7 組織切片制備 兩組大鼠MRI掃描后，常規(guī)左心室灌注固定，取右側(cè)大腦，在于視交叉處斷開(kāi)鼠腦，以此切片為標(biāo)準(zhǔn)冠狀切面，然后向后再切成5mm冠狀切片，用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀位切片，片厚30μm，進(jìn)行免疫組化染色。

1.8 免疫組化染色 采用Power Vision TM二步法進(jìn)行免疫組化染色。冰凍切片用3%過(guò)氧化氫孵育5min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗（濃度為1∶150）為兔來(lái)源 AQP－4多克隆抗體 （美國(guó)Santa Cruz公司）室溫下孵育60min，按二步法免疫組化試劑盒（北京中山公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；DAB顯色時(shí)間統(tǒng)一為3 min，顯色后光鏡觀察。陰性對(duì)照用PBS代替一抗進(jìn)行孵育。.

1.9 圖像分析 采用Leica Qwin生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行染色深淺定量分析，用灰度值（OD value）表示。每只大鼠各取2張切片，每張切片在右側(cè)大腦皮質(zhì)大腦中動(dòng)脈分布區(qū)取3個(gè)區(qū)域測(cè)量其平均灰度值，然后減去各自相同區(qū)域背景區(qū)平均灰度值，取其負(fù)數(shù)，使均為正數(shù)值，兩張切片的均值作為最終平均灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件，兩組均數(shù)間的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，直線相關(guān)分析采用pearson法。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 假手術(shù)組信號(hào)強(qiáng)度 假手術(shù)組大鼠左右側(cè)大腦半球各序列信號(hào)強(qiáng)度相比差異均不明顯（P均＞0.05）。

2.2 腦梗死體積測(cè)定 腦梗死模型大鼠在造模后6h，在DWI序列即開(kāi)始出現(xiàn)梗死灶，至1d時(shí)梗死體積明顯增大，在3d時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸減小，至7d時(shí)仍高于6h時(shí)的梗死體積，不同時(shí)間點(diǎn)間比較差異明顯（F＝58.367，P＜0.01）（圖1～7）。

2.3 T1WI，T2WI，F(xiàn)LAIR序列SIR的測(cè)定 腦梗死模型大鼠在梗死后不同時(shí)間點(diǎn)間，在T1WI T2WI、FLAIR、DWI各序列上SIR差異均明顯（F＝27.790、231.886、86.135、23.467；均 P＜0.01）（表1、2、3、4）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)梗死體積測(cè)定（±s）

圖2 腦梗死后6h T1 WI可見(jiàn)略低信號(hào)梗死灶；圖3 腦梗死后6h T2 WI與前同一層面，可見(jiàn)略高信號(hào)梗死灶；圖4 腦梗死后6h DWI與前同一層面，可見(jiàn)明顯高信號(hào)梗死灶；圖5 腦梗死后3d T2 WI可見(jiàn)體積明顯增大的梗死灶，信號(hào)強(qiáng)度較6h時(shí)增高；圖6 腦梗死后3dDWI與前同一層面，可見(jiàn)體積明顯增大的梗死灶，信號(hào)強(qiáng)度較6h時(shí)增高；圖7 腦梗死后7d T2 WI可見(jiàn)梗死灶體積較3d時(shí)縮小，信號(hào)強(qiáng)度較3d時(shí)降低

表1 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)T1 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

表1 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)T1 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n T1 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15 99.26±0.41 97.34±0.99 101.37±158 100.39±2.98 99.37±1.95腦梗死組 30 96.68±2.41＊ 88.91±1.32＊＊ 83.87±2.03＊＊ 87.46±2.04＊＊ 89.15±1.43＊＊

表2 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)T2 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

表2 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)T2 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01

組別 n T2 WI序列信號(hào)強(qiáng)度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15 100.70±1.91 102.33±1.14 101.37±3.74 102.13±2.58 100.40±2.53腦梗死組 30 106.29±1.69＊ 129.83±2.71＊ 161.66±4.40＊ 148.93±3.21＊ 138.87±4.08＊

表3 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)FLAIR序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

表3 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)FLAIR序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n FLAIR序列信號(hào)強(qiáng)度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15 102.86±1.74 98.83±4.48 99.67±2.61 99.70±3.75 100.85±2.61腦梗死組 30 108.21±4.85＊ 119.64±2.69＊＊ 146.58±4.54＊＊ 132.30±2.93＊＊ 128.06±1.46＊＊

表4 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)DWI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

表4 兩組大鼠腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)DWI序列信號(hào)強(qiáng)度比（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01

組別 n DWI序列信號(hào)強(qiáng)度比6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15 101.65±8.68 107.76±7.11 107.16±12.49 105.59±4.94 104.57±3.53腦梗死組 30 147.89±5.25＊ 169.72±8.22＊ 182.63±4.01＊ 164.69±3.62＊ 148.12±3.14＊

2.4 腦梗死區(qū)皮層AQP4的表達(dá)水平 在腦梗死后6 h梗死側(cè)大腦AQP4表達(dá)水平即增高，主要位于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足包繞毛細(xì)血管壁形成的一層膠質(zhì)界膜上，隨著梗死時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)亦明顯增強(qiáng)，第3 d達(dá)高峰，以后逐漸下降，7 d時(shí)仍高于假手術(shù)組；各時(shí)間點(diǎn)腦梗死組AQP4的表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）；不同時(shí)間點(diǎn)間比較假手術(shù)組AQP4的表達(dá)水平差異不明顯（F＝0.341，P＞0.05），而腦梗死組各時(shí)間點(diǎn)間差異明顯（F＝28.489，P＜0.01）（表5）。

表5 腦梗死側(cè)大腦皮層AQP4表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化（±s，OD值）

表5 腦梗死側(cè)大腦皮層AQP4表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化（±s，OD值）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01

組別 n AQP4表達(dá)水平6 h 1 d 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15 3.58±1.04 3.14±0.71 3.78±1.02 3.20±0.45 3.36±0.56腦梗死組 30 11.26±1.75＊ 14.86±1.25＊ 19.41±2.48＊ 12.19±1.18＊ 10.66±1.16＊

2.5 腦梗死體積與AQP4表達(dá)水平的相關(guān)性分析

腦梗死組大鼠各時(shí)間點(diǎn)病灶側(cè)半球腦梗死體積與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大腦皮層AQP4表達(dá)水平的平均灰度值呈正相關(guān)（r＝0.575，P＜0.01）。

2.6 T1WI、T2WI、FLAIR、DWI序 列 SIR 與AQP4表達(dá)水平的相關(guān)性分析 將腦梗死組大鼠各序列不同時(shí)間點(diǎn)的序列SIR與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)病灶側(cè)大腦皮層AQP4表達(dá)水平的平均灰度值進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示T1WIT的信號(hào)強(qiáng)度比與AQP4的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.610；P＜0.01），T2WI、FLAIR、DWI序列的信號(hào)強(qiáng)度比均與AQP4的表達(dá)水平 呈 正 相 關(guān) （r＝0.586、0.668、0.795；P 均＜0.01）。

3 討 論

本研究通過(guò)MRI對(duì)大鼠腦梗死模型進(jìn)行研究，為了減少M(fèi)RI機(jī)器不穩(wěn)定性、周圍環(huán)境的變化、電源電壓的波動(dòng)等因素造成的系統(tǒng)誤差，本實(shí)驗(yàn)參照朱國(guó)行等實(shí)驗(yàn)的測(cè)量計(jì)算方法，采用信號(hào)強(qiáng)度比的計(jì)算［3］，這樣可減少每次檢查時(shí)老鼠體位差別以及掃描層面不完全一致所造成的人為誤差。DWI（彌散加權(quán)成像）是對(duì)水分子的橫向彌散運(yùn)動(dòng)特別敏感的成像技術(shù)，在局部腦組織缺血后30 min內(nèi)MRI可見(jiàn)水的彌散作用減低，出現(xiàn)高信號(hào)改變，主要反映急性期的細(xì)胞毒性腦水腫，而常規(guī)T2WI在動(dòng)脈阻塞3～4 h才出現(xiàn)高信號(hào)［4］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦梗死后6 h在T1WI、T2WI、FLAIR序列腦梗死灶表現(xiàn)尚不明顯，梗死灶的范圍亦不易確定，而DWI上已經(jīng)出現(xiàn)了較明顯的高信號(hào)梗死灶，故本實(shí)驗(yàn)在腦梗死后6 h在DWI序列上測(cè)量腦梗死體積，而在其它時(shí)間點(diǎn)DWI序列梗死灶的范圍沒(méi)有T2WI、FLAIR序列清晰，本實(shí)驗(yàn)中DWI序列在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖像均有不同程度的變形與偽影，可能與大鼠腦體積較小、彌散加權(quán)圖像的空間分辨率有限、磁敏感效應(yīng)易造成高信號(hào)偽影等有關(guān)，因此在應(yīng)用彌散加權(quán)圖像診斷腦梗死的同時(shí)應(yīng)結(jié)合常規(guī) MRI，以避免假陽(yáng)性。FLAIR序列由于抑制了腦脊液的信號(hào)，同時(shí)增加了T2權(quán)重成分，背景信號(hào)減低，增加了病灶與正常組織間的對(duì)比以及與腦脊液的對(duì)比，對(duì)靠近腦脊液的區(qū)域如皮層、腦室旁的病變的顯示大為改善，故本實(shí)驗(yàn)在腦梗死后1、3、5、7d采用在FLAIR像上測(cè)量梗死體積的變化來(lái)反應(yīng)腦水腫的吸收情況。

AQP4為水分子轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的一種膜蛋白，腦組織中的AQP主要為AQP4，在面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜和腦室室管膜側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜或足突上表達(dá)明顯［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示AQP4在大腦皮層中毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上表達(dá)豐富，同時(shí)皮層邊緣軟腦膜下及腦室周圍的膠質(zhì)細(xì)胞界膜上也有表達(dá)。

近期許多研究表明，AQ4的表達(dá)與腦水腫密切相關(guān)［6］。Taniguchi等的研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈阻塞后AQP4 mRNA的表達(dá)上調(diào)，第3 d達(dá)高峰，第7 d仍處于較高水平，皮質(zhì)的分子層和外顆粒層可見(jiàn)AQP4 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)最強(qiáng)［7］。陳英輝等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AQP4表達(dá)水平在大鼠腦缺血再灌注后6 h即開(kāi)始增高，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸增加，再灌注24～48 h達(dá)到高峰，其表達(dá)與腦組織含水量和伊文氏藍(lán)水平呈正相關(guān)，提示AQP4表達(dá)參與了腦缺血再灌注后繼發(fā)血腦屏障的開(kāi)放和腦水腫的發(fā)生［8］。張新宇等通過(guò)在大鼠腦內(nèi)注射TNF－α后，發(fā)現(xiàn)早期就可出現(xiàn)腦水腫，并測(cè)得AQP4表達(dá)明顯上調(diào)、BBB通透性顯著增加，且二者呈顯著正相關(guān)，推測(cè)TNF－α通過(guò)多種途徑破壞BBB，繼而誘導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步加重腦水腫形成惡性循環(huán)［9］。黃垂學(xué)等采用自由落體硬膜外撞擊法致大鼠重度腦創(chuàng)傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦損傷后4 h，腦組織中AQP4表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，1 d后達(dá)高峰，持續(xù)3 d后下降，7 d時(shí)接近假手術(shù)組水平［10］。

本研究結(jié)果顯示AQP4的表達(dá)水平與MRI上病灶側(cè)半球腦水腫體積、T2WI、FLAIR、DWI序列平均SIR值呈正相關(guān)，與T1WI序列的SIR呈負(fù)相關(guān)。T2WI對(duì)組織總含水量增加的血管源性水腫敏感［11］，這亦從側(cè)面說(shuō)明了AQP4的表達(dá)水平與血腦屏障破壞導(dǎo)致的血管源性腦水腫有關(guān)。DWI的高信號(hào)改變主要反映急性期的細(xì)胞毒性腦水腫，本實(shí)驗(yàn)在腦梗死后的急性期與亞急性早期AQP4的表達(dá)水平與DWI的平均SIR值呈正相關(guān)，說(shuō)明AQP4的表達(dá)水平與腦梗死后細(xì)胞毒性腦水腫的形成發(fā)展亦密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合MRI的各項(xiàng)腦水腫指標(biāo)從多個(gè)方面說(shuō)明腦梗死后AQP4的表達(dá)促發(fā)了缺血性腦水腫的形成與發(fā)展，且腦梗死后AQP4的過(guò)度表達(dá)可能與血管源性腦水腫及細(xì)胞毒性腦水腫形成與發(fā)展均相關(guān)。

AQP4在腦中作用的具體機(jī)制及其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制還不十分明確，且存在很大的分歧，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。針對(duì)AQP4進(jìn)行調(diào)控從而為臨床治療腦水腫研提供新的思路與理論依據(jù)的研究具有越來(lái)越廣闊的前景。由于研究技術(shù)、設(shè)備的限制，對(duì)超早期（＜6 h）的梗死尚未進(jìn)行研究，隨著MRI設(shè)備的更新和新技術(shù)的發(fā)展，平面回波（EPI）／T2＊ WI、梯度回波 （GRE）／T2＊ WI、灌注成像（PWI）和MR波譜（MRS）等的運(yùn)用，還可對(duì)缺血周圍的血流、理化性質(zhì)改變等作進(jìn)一步的分析，將有利于對(duì)腦梗死后腦水腫的形成機(jī)制及治療作更深層次的研究。

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