鄭紅云 李 艷 童永清

神經(jīng)元的極性是指絕大多數(shù)神經(jīng)元存在一個(gè)長(zhǎng)的軸突和幾個(gè)短的樹突。對(duì)于一個(gè)神經(jīng)元來(lái)說(shuō)，樹突往往是接受信息的部位，軸突往往是輸出信息的部位，因此神經(jīng)元的極性是保證信息在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部及神經(jīng)系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間有序流動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是神經(jīng)元極性形成的分子機(jī)制仍是一個(gè)有趣且具挑戰(zhàn)性的問題。

胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)是研究神經(jīng)元極性的良好模型［1］。海馬神經(jīng)元極性的建立經(jīng)歷層狀偽足、無(wú)極性的突起以及軸突和樹突形成三個(gè)階段［2］。研究表明，微管對(duì)軸突和樹突的分化成熟起著關(guān)鍵作用［3］；進(jìn)一步研究揭示微管相關(guān)蛋白tau和微管相關(guān) 蛋 白 1B（microtubule－associated protein 1B，MAP1B）促進(jìn)神經(jīng)元軸突的形成［4］；腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsin response mediator protein－2，CRMP－2）可結(jié)合管蛋白，促進(jìn)微管聚集，進(jìn)而調(diào)節(jié)軸突和樹突極性形成［5］。最近2項(xiàng)研究表明糖原激酶合酶3（（glycogen synthase kinase 3，GSK－3（）通過調(diào)節(jié) CRMP－2磷酸化狀態(tài)影響神經(jīng)元極性［6，7］。大量事實(shí)表明蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)與神經(jīng)元極性形成關(guān)系密切，而蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)受蛋白磷酸激酶和磷酸酯酶的雙向調(diào)節(jié)。近年來(lái)研究報(bào)道了激酶對(duì)神經(jīng)元極性的影響，而蛋白磷酸酯酶對(duì)神經(jīng)元極性的影響尚無(wú)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用蛋白磷酸酯酶（PP2A）特異性抑制劑OA在海馬神經(jīng)元極性形成的早期處理海馬神經(jīng)元，探討PP2A在神經(jīng)元極性形成中是否起作用，為神經(jīng)元發(fā)生的機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 孕18 d的SD大白鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供）。

1.2 試劑及抗體 OA購(gòu)于Calbiochem公司（La Jalla，CA，USA），DMSO購(gòu)于sigma公司。MAP2和Tau－1購(gòu)于Chemicon公司。

1.3 原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出孕18 d胎鼠的完整腦組織，剔除腦膜和血管，鈍性分離出雙側(cè)海馬；將海馬剪成1 mm3的組織塊（以上均在冰上進(jìn)行），置入解剖液（含3%～6%葡萄糖D－Hanks）中，0.125%胰蛋白酶（Gibco，USA）37℃消化15 min，加入種植培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）終止反應(yīng)，滴管吹打后經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，1500 r／min離心5 min，加入適當(dāng)?shù)姆N植培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)至1x107／L，接種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后換成維持培養(yǎng)基（含5%小牛血清、2%B27的DMEM培養(yǎng)基）。

1.4 OA處理海馬神經(jīng)元 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)24 h后分別給予不同濃度的OA處理細(xì)胞24 h，普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.5 免疫熒光雙重標(biāo)記 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)24 h，即給予OA處理細(xì)胞24 h后吸出培養(yǎng)基，0.01 M磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗后加入100%甲醇－20 ℃固定5 min，PBS－0.2%Triton漂洗，然后 PBS－0.5%Triton破膜5～10 min，PBS－0.2%Triton漂洗，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h，分別滴加鼠抗Tau－1（1∶200）和兔抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule－associated protein－2，MAP－2）（1∶1000），于4℃孵育過夜，漂洗后加入熒光標(biāo)記Ⅱ抗于室溫孵育1 h，漂洗后于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件（statistical product and service solutions 11.0，SPSS 11.0），全部數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，采用Image－Proplus軟件統(tǒng)計(jì)突起長(zhǎng)度。

2 結(jié) 果

2.1 正常海馬神經(jīng)元極性形成的形態(tài)觀察

普通光學(xué)顯微鏡下可見種植4 h后少部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞表面呈現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)層狀偽足；種植12 h后大部分細(xì)胞貼壁，多數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)無(wú)分支的突起；種植24 h后細(xì)胞完全貼壁，可見雙突起、三個(gè)突起和多個(gè)突起的神經(jīng)元，其中一個(gè)突起迅速生長(zhǎng)成為軸突；種植48 h后其它的突起發(fā)展成為樹突，并且突起之間交錯(cuò)成網(wǎng)（圖1）。

圖1 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48 h后固定做免疫熒光，分別采用軸突特異性標(biāo)記物Tau－1和樹突特異性標(biāo)記物MAP2標(biāo)記神經(jīng)元（Bar＝20μm）

2.2 OA抑制原代海馬神經(jīng)元軸突生成

普通光學(xué)顯微鏡下可見DMSO對(duì)照組神經(jīng)元的軸突和樹突已經(jīng)形成，神經(jīng)元極性完全建立；采用PP2A抑制劑OA處理24 h后各濃度組神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)均受到了不同程度的抑制，且隨OA濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性（圖2）。與對(duì)照組（平均長(zhǎng)度為185μm）相比，不同濃度OA處理后神經(jīng)元軸突平均長(zhǎng)度分別為150μm、100 μm、80μm、75μm、50μm。

3 討 論

神經(jīng)元極性形成對(duì)其功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要，探索神經(jīng)元極性形成的分子基礎(chǔ)尤為迫切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見正常海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48 h后極性已完全形成，而培養(yǎng)24 h后用PP2A特異性抑制劑OA處理后普通光學(xué)顯微鏡下可見隨OA濃度的增加，對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴性，該結(jié)果提示PP2A參與了神經(jīng)元極性的形成。

OA是一種廣泛使用的PP2A選擇性抑制劑。最新研究表明OA處理皮質(zhì)神經(jīng)元可導(dǎo)致tau蛋白和CRMP－2均發(fā)生不同程度的磷酸化，并首次提出CRMP－2磷酸化狀態(tài)受PP2A活性的調(diào)節(jié)［8］。微管相關(guān)蛋白tau、MAP1B以及CRMP－2可結(jié)合管蛋白，促進(jìn)微管聚集，進(jìn)而調(diào)節(jié)軸突和樹突極性形成［9，10］。在發(fā)育的新生海馬神經(jīng)元軸突末端以及生長(zhǎng)錐，tau蛋白、MAP1B以及CRMP－2主要以非磷酸化形式存在［11］；GSK－3β磷酸化 CRMP－2降低其與管蛋白的結(jié)合能力，抑制微管的聚集和神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)［12］，而PP2A廣泛存在于微管相關(guān)蛋白區(qū)域［13］，可以去磷酸化tau蛋白、MAP1B和 CRMP－2而促進(jìn)微管聚集。因此，tau蛋白、MAP1B和CRMP－2可能作為PP2A下游靶分子以調(diào)節(jié)神經(jīng)元極性。

圖2 不同濃度OA處理后對(duì)神經(jīng)元軸突形成的影響

在常見神經(jīng)退行性疾病如Alzheimer病（AD）患者腦中PP2A活性明顯降低，tau蛋白以高度磷酸化的形式存在［14］，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)元極性的喪失并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的大量丟失，因此上調(diào)PP2A對(duì)促進(jìn)AD患者腦中神經(jīng)元正常生存意義重大。因此，該研究為神經(jīng)元極性形成的分子機(jī)制提供了新資料，同時(shí)為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

1 Arimura N，Kaibuchi K.Neuronal polarity：from extracellular signals to intracellular mechanisms.Nat Rev Neurosci，2007，8（3）：194－205.

2 Szu－Yu Ho，Rasband MN.Maintenance of neuronal polarity.Dev Neurobiol，2011，71（6）：474－482.

3 Buck KB，Zheng JQ.Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.J Neurosci，2002，22（21）：9358－9367.

4 Tahirovic S，Bradke F.Neuronal polarity.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1（3）：16－44.

5 Arimura N.Role of CRMP－2 in neuronal polarity.J Neurobiol，2004，58（1）：34－47.

6 Jiang H，et al.Both the establishment and the maintenance of neuronal polarity require active mechanisms：critical roles of GSK－3beta and its upstream regulators.Cell，2005，120（1）：123－135.

7 Yoshimura T.GSK－3beta regulates phosphorylation of CRMP－2 and neuronal polarity.Cell，2005，120（1）：137－149.

8 Hill JJ.Identification of okadaic acid－induced phosphorylation events by a mass spectrometry approach.Biochem Biophys Res Commun，2006，342（3）：791－799.

9 Hirai S.Axon formation in neocortical neurons depends on stagespecific regulation of microtubule stability by the dual leucine zipper kinase－c－Jun N－terminal kinase pathway.J Neurosci，2011，31（17）：6468－6480.

10 Hoogenraad CC，Bradke F.Control of neuronal polarity and plasticity－－a renaissance for microtubules？Trends Cell Biol，2009，19（12）：669－676.

11 Yoshimura T，Arimura N，Kaibuchi K.Molecular mechanisms of axon specification and neuronal disorders.Ann N Y Acad Sci，2006，1086：116－125.

12 Ni MH.GSK－3 mediates the okadaic acid－induced modification of collapsin response mediator protein－2 in human SK－N－SH neuroblastoma cells.J Cell Biochem，2008，103（6）：1833－1848.

13 Awotunde OS.Interaction of maize（Zea mays）protein phosphatase 2A with tubulin.Acta Biochim Pol，2003，50（1）：131－138.

14 Small SA，Duff K.Linking Abeta and tau in late－onset Alzheimer＇s disease：a dual pathway hypothesis.Neuron，2008，60（4）：534－542.