周 靜，王成蹊，潘弟儀，周 濤，侯連兵

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515)

甲狀腺功能亢進(jìn)癥(hyperthyroidism)簡(jiǎn)稱甲亢，可影響全身多系統(tǒng)、多器官功能，近年來(lái)甲亢合并肝臟損害在臨床上多有報(bào)道。目前關(guān)于甲亢合并肝損害的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞基因異常調(diào)控及凋亡機(jī)制參與了其病理?yè)p傷過(guò)程，故推測(cè)細(xì)胞凋亡是造成肝損害的重要因素[1]。因?qū)幤悄戏结t(yī)院治療甲亢的醫(yī)院制劑，能有效控制甲亢的癥狀和體征[2]，并對(duì)肝臟有保護(hù)作用。本研究旨在觀察因?qū)幤瑢?duì)甲亢大鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的影響，探討其藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，SPF級(jí)，體重180～220 g，雌雄各半，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK粵2006-0015。甲狀腺片(40 mg/片，上海實(shí)業(yè)聯(lián)合集團(tuán)長(zhǎng)城藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20090501);因?qū)幤?由黃芪、當(dāng)歸、生地、鱉甲、麥冬等9味藥材組方，廣州南方醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)為20051230);甲亢靈片(湖南飛鴿藥業(yè)有限公司，批號(hào)為0901052)。SDS電泳系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-rad公司);Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)(美國(guó) Kodak公司);磁力攪拌器(PH baiskT/C);多標(biāo)記微孔檢測(cè)儀(VICTOR3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與試驗(yàn)方法

取60只SD大鼠，按體重、性別相近原則隨機(jī)分為6組，每組10只，即空白對(duì)照組(A組)，模型組(B組)，因?qū)幤蛣┝拷M(C1組)、中劑量組(C2組)、高劑量組(C3組)，甲亢靈陽(yáng)性對(duì)照藥組(D組)。喂養(yǎng)適應(yīng)1周后，除A組以等量生理鹽水灌胃外，其余5組灌胃給予甲狀腺片1.2 g/(kg·d)。造模30 d后，除A組繼續(xù)給予等量生理鹽水灌胃、B組繼續(xù)灌胃甲狀腺片外，其余4組在給予甲狀腺片的同時(shí)分別灌胃給予因?qū)幤?.6，1.2，2.4 g/(kg·d)和陽(yáng)性藥甲亢靈1.2 g/(kg·d)，各組均再連續(xù)給藥30 d。末次給藥后24 h，以10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，腹腔靜脈采血，4 000 r/min離心10 min，取血清，用放射免疫法測(cè)血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取肝臟，液氮速凍后，放置-80℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 Western-Blot法檢測(cè)Caspase-3和Bcl-2蛋白水平

組織蛋白樣品提取:稱取大鼠的肝臟組織100 mg，剪碎，每50 mg組織加入300 μL Western和IP細(xì)胞裂解液(之前加入蛋白酶抑制劑和苯甲基磺酰氟)，于冰上靜置60 min，低溫高速離心2次(每次以12 000 r/min離心10 min)，取上清液，即為提取的肝臟組織總蛋白。

蛋白質(zhì)定量(BCA蛋白定量法):以Solutian A加Solutian B(50∶1)配制BCA工作液，充分混勻。以1∶30稀釋蛋白樣品，按說(shuō)明書(shū)加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品至96孔板中，每孔稀釋至20 μL，加入200 μL BCA工作液，混勻，37℃放置30 min。測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處的吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)與Western印跡:1)樣品處理。吸取150 μg肝臟組織總蛋白，加入5倍體積電泳上樣緩沖液(Tris-Cl 250 mmol/L，pH=6.8，10%十二烷基磺酸鈉，500 mmol/L二硫蘇糖醇，50%甘油，0.5%溴酚藍(lán))，98℃加熱 5 min，變性。2)跑膠。灌制12%SDS-PAGE分離膠，5%SDSPAGE積層膠，上樣150 μg肝臟組織總蛋白(體積大約25 μL)。3)電泳。恒壓80 V、維持40 min，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓提高到120 V、維持90 min直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，根據(jù)Mark條帶的相對(duì)分子質(zhì)量切下目的蛋白和內(nèi)參。4)半干轉(zhuǎn)膜。恒流120 mA，維持70 min，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，TBS-T洗脫液洗脫，每次5 min，洗3次。5)加一抗:兔多克隆抗體Caspase-3以1∶300稀釋，兔多克隆抗體Bcl-2以1∶500稀釋，兔多克隆抗體βactin以1∶1 000稀釋，4℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗脫液洗脫，每次5 min，洗3次。6)加二抗:鼠抗、兔二抗以1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h，用 BeyoECl Plus發(fā)光液顯影。7)分析:以 Kodak Image Station 2000 MM成像系統(tǒng)采集圖像，將獲得圖像用Image Tool 3.0圖像處理軟件分析，用Caspase-3/β-actin代表Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量，以Bcl-2/β-actin代表Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺功能與肝功能變化

結(jié)果見(jiàn)表1。與A組比較，B組血清T3和T4水平升高，而TSH反饋性降低，肝功能出現(xiàn)明顯異常;治療后，C1，C2，C3組和D組T3和T4水平均降低，TSH水平升高，肝功能明顯改善，與B組比較有顯著性差異(P＜0.05)，且因?qū)幤鹘M呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量組作用最明顯。

表1 各組血清甲狀腺功能和肝功能指標(biāo)比較(n=10，±s)

表1 各組血清甲狀腺功能和肝功能指標(biāo)比較(n=10，±s)

注:與 B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01(下表同)。

組別 甲狀腺功能 肝功能A組B組C1組C2組C3組D組T3(nmol/L)2.15±0.82▲6.74±1.73 5.82±1.66△4.61±0.83△4.27±0.62△4.87±1.05△T4(nmol/L)35.21±9.91▲183.61±22.79 125.36±15.87△98.61±10.05△85.32±17.25△106.59±19.29△TSH(mU/L)3.47±0.13▲1.76±0.07 2.63±0.50△2.78±0.74△2.89±0.81△2.82±0.63△ALT(U/L)49.27±8.63▲108.25±21.31 86.44±10.72△75.22±12.87△69.39±10.15△88.13±11.08△AST(U/L)134.94±18.55▲289.36±36.73 217.33±24.19△191.83±15.94△182.45±16.80△205.09±19.92△

2.2 對(duì)甲亢大鼠肝組織Caspase－3和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)表2、圖1和圖2?？梢?jiàn)，對(duì)Caspase-3和 Bcl-2蛋白表達(dá)的影響大小排序?yàn)镃3組、D組、C2組。

表2 各組大鼠肝組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組大鼠肝組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較(±s)

組別A組(n=10)B組(n=10)C1組(n=10)C2組(n=10)C3組(n=10)D組(n=10)Caspase-3蛋白0.952 2±0.022 8▲1.270 7±0.022 7 1.220 8±0.022 4 1.138 3±0.026 3△0.920 6±0.016 0▲0.962 7±0.032 1▲B(niǎo)cl-2蛋白1.020 6±0.014 2▲0.576 7±0.034 4 0.697 7±0.448 4 0.885 7±0.012 2△0.936 2±0.008 3▲0.884 2±0.011 1△

圖1 Western Blot測(cè)定各組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

圖2 各組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較注:與 B組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

3 討論

甲狀腺激素可影響機(jī)體所有組織器官的代謝過(guò)程。從1874年Habershon[3]首次描述甲亢患者合并肝損害后，相關(guān)的病例在臨床上被廣泛報(bào)道，但有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不多，鮮有中藥復(fù)方治療甲亢合并肝損害的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。甲狀腺和肝臟的相互作用包括甲亢全身作用繼發(fā)的肝損害和甲狀腺激素對(duì)肝臟的直接作用。多數(shù)情況下，肝臟損害表現(xiàn)為非特異性脂肪變，包括脂肪浸潤(rùn)、胞質(zhì)空泡化、核不規(guī)則、線粒體數(shù)量減少、嵴消失等改變。越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡在非酒精性脂肪變(包括肝缺血-再灌注損傷、肝炎、肝腫瘤等)中起重要作用[4]。國(guó)外也有報(bào)道，甲亢鼠肝臟存在細(xì)胞凋亡過(guò)程異?？哼M(jìn)[5]。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞凋亡各個(gè)階段都可以檢測(cè)到不同程度的Caspase增高。Caspase在組織中含量的改變決定了細(xì)胞凋亡的進(jìn)展方向[6]。凋亡是蛋白酶級(jí)聯(lián)切割的過(guò)程，其中Caspase-3處于核心位置，不同的蛋白酶切割Caspase-3酶原，活化的Caspase-3又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶切割級(jí)聯(lián)放大，從而激活核酸酶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，DNA裂解使染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞皺縮，形成凋亡小體，最終使細(xì)胞走向死亡[6]。Caspase-3是執(zhí)行性Caspase，因此被稱為死亡蛋白酶。本研究顯示，甲亢模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，表明肝細(xì)胞凋亡亢進(jìn);各治療組Caspase-3蛋白表達(dá)與模型組比較明顯下降，以因?qū)幤邉┝拷M最明顯，表明因?qū)幤芤种聘渭?xì)胞凋亡的核心因子Caspase-3的表達(dá)，這可能是因?qū)幤种萍?xì)胞凋亡、保護(hù)肝組織的重要作用機(jī)制之一。

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2家族位于線粒體外膜上，包括抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax，Bad 等)。其中Bcl-2是一種重要的凋亡抑制蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱甘肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性，阻止凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C從線粒體的釋放，抑制凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，甲亢鼠Bcl-2蛋白表達(dá)下降，說(shuō)明甲亢時(shí)抗凋亡蛋白表達(dá)抑制;經(jīng)藥物治療后，各組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，肝細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明因?qū)幤瑢?duì)肝細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有一定的作用。

本研究中觀察到，在給大劑量甲狀腺激素造成轉(zhuǎn)氨酶(AST和ALT)升高的同時(shí)，肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，說(shuō)明凋亡是Caspase依賴性的，過(guò)多的甲狀腺激素使大鼠肝組織細(xì)胞凋亡平衡被打破，凋亡通路中的執(zhí)行蛋白酶被激活，抗凋亡蛋白表達(dá)受抑制，細(xì)胞凋亡亢進(jìn)，從而造成肝細(xì)胞損害。高、中、低劑量的因?qū)幤完?yáng)性藥甲亢靈能降低血中甲狀腺激素T3及T4水平，降低轉(zhuǎn)氨酶含量，逆轉(zhuǎn)凋亡異?？哼M(jìn)。高、中劑量的因?qū)幤黠@降低Caspase-3蛋白的表達(dá)，提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)?？梢?jiàn)，因?qū)幤淖饔贸尸F(xiàn)出良好的劑量依賴性量效關(guān)系。

因?qū)幤韵`軟堅(jiān)、解毒散結(jié)原理組方，治療甲亢的臨床效果顯著，能降低血中甲狀腺激素的水平，改善甲亢癥狀和體征。本研究證明，因?qū)幤茱@著抑制甲亢時(shí)肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝損傷、保護(hù)肝臟。為明確因?qū)幤乃幚碜饔脵C(jī)制，對(duì)肝細(xì)胞凋亡的其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用尚有待進(jìn)一步研究。

[1]Kumarl A，Sinha1 RA，Tiwari1 M，et al.Hyperthyroidism induces apoptosis in rat liver through activation of death receptor-mediated pathways[J].Journal of Hepatology，2007，46(5):888-898.

[2]張 薇，侯連兵，李 平，等.因?qū)幤瑢?duì)實(shí)驗(yàn)性陰虛大鼠的藥效學(xué)研究[J].中藥材，2007，30(3):326-328.

[3]Habershon SO.Exophthalmic goiter，heartdisease;jaundice:death[J].Lancet，1874，1:510-512.

[4]Panasiuk A，Dzieciol J，Panasiuk B，et al.Expression of p53，Bax and Bcl-2 proteins in hepatocytes in non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2006，12:6 198-6 202.

[5]Upadhyay G，Singh R，Kumar A，et al.Severe hyperthyroidism induces mitochondria-mediated apoptosis in rat liver[J].Hepatology，2004，39(4):1 120-1 130.

[6]Contreras JL，Vilatoba M，Eckstein C，et al.Caspase-8 and Caspase-3 small interfering RNA decreases ischemia/reperfusion injury to the liver in mice[J].Surgery，2004，136(2):390-400.

[7]Girisx M，Sc M，Erbil Y，et al.Heme Oxygenase-1 Prevents Hyperthyroidism Induced Hepatic Damage via an Antioxidant and Antiapoptotic Pathway[J].Journal of Surgical Research，2009，4(13):1-10.