莫?jiǎng)偬m，鄭 敏，陳義祥，胡 杰，屈素潔，梁 媛，粟艷瓊，2，陸文俊，蘇 凱，陳玉華，李 軍，劉 棋，2＊

（1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧 530001）

水禽可以自然感染A型禽流感病毒的所有亞型，并通過(guò)多種途徑直接或間接地將病毒傳染給其他禽類和哺乳動(dòng)物，被認(rèn)為是禽流感病毒基因儲(chǔ)存庫(kù)和新毒株的重要來(lái)源，因此，在禽流感病毒的遺傳進(jìn)化和流行病學(xué)中具有重要意義［1－2］。根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，A型禽流感病毒（Influenza A virus）可分成16個(gè)不同的HA亞型和9個(gè)NA亞型［3］。在眾多A型禽流感病毒亞型中，只有H5和H7亞型中的部分病毒才能引起高致病性禽流感，但越來(lái)越多的研究表明，禽類中的低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）往往通過(guò)基因重排方式產(chǎn)生新的病毒，一些新的病毒毒力增強(qiáng)或具有感染人的潛力。Wang C W 等［4－5］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)水禽無(wú)癥狀的 H6亞型禽流感病毒株在感染家雞后會(huì)引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降和上呼吸道病變，甚至引起感染雞死亡，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，其原因可能是H6亞型禽流感病毒在由水禽傳染至家雞的過(guò)程中毒力發(fā)生了變異而導(dǎo)致后者發(fā)病。另外，Chin P S等［6］報(bào)道，一株從野鴨體內(nèi)分離到的 H6N2亞型禽流感病毒 A／teal／HongKong／W312／97（H6N2）與 能 致 人 死 亡 的H5N1亞型禽流感病毒株（A／Chick／HongKong／156／97（H5N1）的7個(gè)基因高度同源，推測(cè)前者很可能為后者提供了基因，使后者成為具有感染人能力的新病毒。因此，加強(qiáng)對(duì)H6等LPAIV的監(jiān)測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。廣西自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心在對(duì)廣西活禽市場(chǎng)進(jìn)行禽流感病毒帶毒狀況的監(jiān)測(cè)過(guò)程中，從健康家鴨中分離鑒定出一株H6N6亞型禽流感病毒，將其命名為A／duck／GX／038／2009（H6N6）（Dk／GX／038／09），并對(duì)其 HA和NA基因進(jìn)行了克隆和序列分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和試劑 禽流感病毒 Dk／GX／038／09由廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離鑒定和保存；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑、Taq DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD－18T載體等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 引物 依據(jù)GenBank上發(fā)表的H6N6亞型禽流感病毒HA和NA基因片段兩端核苷酸保守序列采用Primer 6.0軟件分別設(shè)計(jì)出2對(duì)引物，HA 基 因 引 物 6HA－R： 5′－ACAAGGGTGTTTTTCTTAAT－3′，6HA－F：5′－AGCAAAAGCAGGGGAAAA－3，預(yù)期擴(kuò)增 HA基因片段為1 737bp；NA 基 因 引 物 6NA－F：5′－AGCAAAAGCAGGAGTGAAGA－3，6NA－R： 5′－TTTTCTAAAATTGCGAAAGC－3，預(yù)期擴(kuò)增NA基因片段為1 449bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取250μL病毒尿囊液，加入750μL Trizol試劑，混勻后室溫靜置5 min，加入200μL氯仿，輕微振蕩混勻，4℃、12 000 r／min離心10min，取上清約500μL，加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫靜置10min，12 000r／min離心10min，沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

1.2.2 RT－PCR 取病毒RNA懸液15μL，與流感病毒隨機(jī)引物1μL（20pmol／μL）混合，加入 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5×buffer 5μL、dNTP（10mmol／L）2 μL、RNasin 1μL（20U）、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL（5 U），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25μL?；旌衔镏糜?2℃作用60min。PCR反應(yīng)體系：10×Taq聚合酶緩沖液5μL，dNTP（10mmol／L）2μL，上、下游引物（20 pmol／μL）各1μL，cDNA 2.5μL，Taq DNA聚合酶1μL（5U），用無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃2min；94℃35s，53℃35s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μL，在10 g／L瓊脂凝膠上電泳檢查結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、克隆和序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后，與pMD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒并用PCR鑒定。每個(gè)樣品挑取陽(yáng)性克隆，由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.2.4 同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建 應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)測(cè)序基因片段進(jìn)行拼接和氨基酸序列推導(dǎo)，利用GenBank中的BLAST軟件查找核苷酸和氨基酸的同源序列，并用MEGA 4.0軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 HA和NA基因擴(kuò)增

經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增到的HA基因片段長(zhǎng)約1.7kb，擴(kuò)增到的NA基因片段長(zhǎng)約1.5kb，兩個(gè)基因的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度一致（圖1）。

圖1 HA和NA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of HA and NA gene

2.2 核苷酸同源性分析

測(cè)序結(jié)果顯示Dk／GX／038／09的 HA基因全長(zhǎng)為1 737bp。利用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行同源性搜索比對(duì)顯示，Dk／GX／038／09的 HA基因與廣東 A／duck／Shantou／17887／2005（H6N6）、A／duck／Shantou／8379／2005（H6N2）等 H6亞型毒株HA基因核苷酸同源性最高，達(dá)97.0%；與江蘇A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）和福建 A／duck／Fujian／12035／2005（H6N6）等 H6N6亞型毒株相應(yīng)基因同源性則相對(duì)較低，分別為95%和93%。值得注意的是，Dk／GX／038／09的 HA基因核苷酸與廣西2005年鴨源 H6N2毒株 A／duck／Guangxi／141／2005的HA基因同源性更低，只有86.5%。

對(duì) NA 基因的測(cè)序結(jié)果顯示，Dk／GX／038／09的NA基因片段長(zhǎng)度為1 449bp，與GenBank中收錄的參考毒株進(jìn)行了同源性比較。結(jié)果表明，Dk／GX／038／09的 NA 基 因與廣東 鴨源毒 株 如 A／duck／Shantou／20313／2005（H6N6）和福建鴨源毒株 A／duck／Fujian／11661／2005（H6N6）等的同源性最高，達(dá)98.0%；而與江蘇鴨源毒株 A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）的NA基因核苷酸同源性則只有88.6%，差異較大。

2.3 基因推導(dǎo)氨基酸分析

對(duì)Dk／GX／038／09的 HA基因推導(dǎo)氨基酸分析顯示，其HA基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 701bp，編碼566個(gè)氨基酸，HA1含有344個(gè)氨基酸，HA2含有221個(gè)氨基酸，不存在核苷酸缺失。HA1和HA2裂解位點(diǎn)的序列為 P－Q－I－E－T－R－D，僅含一個(gè)堿性氨基酸，具有典型低致病性禽流感病毒的特征序列。同時(shí)，該毒株HA受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列為K226－S227－P228－E229，與人類受體位點(diǎn)氨基酸序列不同，暫時(shí)不存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)Dk／GX／038／09的NA基因推導(dǎo)氨基酸分析顯示該基因編碼470個(gè)氨基酸，中間不存在任何氨基酸缺失。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Dk／GX／038／09的NA基因氨基酸與廣東鴨源毒株A／duck／Shantou／8365／2005（H6N6）的相應(yīng)氨基酸同源性最高，為 99%；與 江 蘇 鴨 源 毒 株 A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）的相應(yīng)氨基酸同源性較低，為93.0%。

2.4 HA和NA基因遺傳進(jìn)化樹分析

圖2 HA基因進(jìn)化圖Fig.2 Phylogenetic trees of HA gene

圖3 NA基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees of NA gene

HA基因遺傳進(jìn)化樹（圖2）顯示，Dk／GX／038／09與廣東分離的多個(gè)鴨源H6N6毒株如A／duck／Shantou／8365／2005（H6N6）和 H6N2 毒株如 A／duck／Shantou／17887／2005（H6N2）等位于同一分支上，遺傳距離很近；而與江蘇、福建、香港以及臺(tái)灣等其他地區(qū)分離的H6亞型流感毒株的遺傳距離較遠(yuǎn)。

在 NA基因進(jìn)化樹上（圖3）顯示，Dk／GX／038／09與廣東、福建分離的H6N6亞型流感毒株位于同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)；與江蘇、香港等地的H6亞型禽流感病毒分離株則位于不同的分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室首次在廣西自治區(qū)分離到H6N6亞型禽流感病毒并對(duì)其HA和NA基因進(jìn)行了序列分析和繪制基因遺傳進(jìn)化樹，初步明確了該病毒在廣西的流行態(tài)勢(shì)。由于該病毒的NA和HA基因序列與廣東相應(yīng)毒株最為接近，因而推測(cè)Dk／GX／038／09與廣東分離的H6N6亞型流感毒株可能來(lái)自同一祖先病毒，這也許與廣東和廣西密切的家禽產(chǎn)品交易相關(guān)。江蘇、香港、臺(tái)灣等地區(qū)分離的H6毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，則表明目前在中國(guó)流行的H6亞型禽流感病毒存在一定的地域差異性和基因遺傳多樣性。同時(shí)，顧敏等［7］報(bào)道，江蘇分離的鴨源H6N6毒株 A／duck／Jiangsu／022／2009為基因重排病毒，8個(gè)基因比較復(fù)雜，但均屬于歐亞系。而萬(wàn)春和等［8］也報(bào)道我國(guó)福建分離的另一株鴨源 H6N6毒株 A／Muscovy／duck／Fujian／FZ01／2008也為多亞型禽流感病毒基因重排產(chǎn)物。因此，Dk／GX／038／09也存在基因重排的可能性，但仍需要進(jìn)一步證實(shí)其內(nèi)部基因。

表面糖蛋白基因HA和NA之間的協(xié)調(diào)與病毒的增殖和復(fù)制密切相關(guān)，HA蛋白是禽流感病毒最主要的表面糖蛋白，而NA蛋白則在病毒的成熟和釋放中起重要作用。這兩個(gè)蛋白也是宿主免疫系統(tǒng)最主要的靶抗原［9］。HA基因的突變有可能引起抗原變異，使病毒能夠逃避宿主免疫壓力而獲得選擇優(yōu)勢(shì)［10］。本次研究發(fā)現(xiàn)，兩廣地區(qū)流行的H6N6病毒從2005年至2009年間其HA和NA基因核苷酸變異均較小，原因可能是H6N6亞型禽流感病毒相對(duì)于人禽流感病毒而言，所受的免疫壓力小。因?yàn)樵摬《局饕腥绝?，而鴨的飼養(yǎng)模式則決定了鴨的存活時(shí)間較短，對(duì)H6N6亞型禽流感病毒有免疫力的鴨較少，使得病毒不需過(guò)多地改變自身來(lái)適應(yīng)宿主。所以近幾年來(lái)，流行于兩廣地區(qū)的H6N6亞型禽流感病毒基因進(jìn)化沒(méi)有明顯加快的跡象，但新的基因重排H6N6亞型禽流感病毒增多的趨勢(shì)可能存在。

廣西處于中國(guó)溫暖潮濕的華南地區(qū)，是多種侯鳥遷徙路線的必經(jīng)之地，同時(shí)該地區(qū)水網(wǎng)密布，四季放養(yǎng)或混養(yǎng)，這一特殊的生態(tài)環(huán)境加上該地區(qū)獨(dú)特的地理氣候條件和人們的生活習(xí)慣等，使得候鳥、水禽、豬、人頻繁接觸并交叉循環(huán)感染，具備禽流感病毒生存與傳播的天然條件，國(guó)外眾多學(xué)者把中國(guó)南方稱為“流感起源中心”［11］。因此，準(zhǔn)確地了解和把握廣西水禽群體中的禽流感病毒的多樣性，對(duì)我國(guó)預(yù)防禽流感的發(fā)生是非常重要的。H6亞型禽流感病毒是我國(guó)南方地區(qū)家鴨中比較常見(jiàn)的亞型，因此，對(duì)H6亞型病毒進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)可為預(yù)防和控制禽流感提供重要的流行病學(xué)信息。

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