羅繼分，王靜梅，剡根強(qiáng)

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

2009年初冬至2011年初春季節(jié)，新疆石河子某規(guī)?；膛龅牟糠殖跎鸂倥ｊ懤m(xù)發(fā)生了以腦炎為主的病例。發(fā)病犢牛表現(xiàn)體溫升高，咳嗽，共濟(jì)失調(diào)，頭低耳耷，拱背，精神沉郁，消瘦，抗生素治療效果不佳，先后死亡9頭。剖檢瀕死期犢牛發(fā)現(xiàn)，肺臟出血且有肉變，腎盂出血，小腸嚴(yán)重出血，腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫大，腦膜廣泛的小點(diǎn)出血。為查明導(dǎo)致該病發(fā)生的主要致病菌，本研究對患腦炎的犢牛進(jìn)行了病原菌的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原材料 采集新疆石河子某發(fā)病牛場的犢牛肝臟、腸淋巴結(jié)、脾臟、心血和肺臟等共24份。1.1.2 培養(yǎng)基與生化試劑 LB血培養(yǎng)基，鏈球菌選擇培養(yǎng)基，肉肝湯厭氧培養(yǎng)基，各種生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基等參照文獻(xiàn)［1］配制。

1.1.3 分離株16SrDNA測序 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測定；分子生物學(xué)試劑DNA Marker DL 2 000，Taq酶（5U／μL）、dNTP（10mmol／L）均為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；根據(jù)測序結(jié)果選擇最合適的序列設(shè)計(jì)引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物 健康小鼠和家兔，購自于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.5 病理切片 采集發(fā)病犢牛和人工感染死亡的小鼠的腦組織，制作石蠟切片。

1.1.6 藥敏試驗(yàn) 阿奇霉素、阿莫西林、四環(huán)素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、萬古霉素、利福平、泰樂菌素、土霉素、青霉素、頭孢噻呋鈉、慶大霉素、恩諾沙星、卡那霉素、氟苯尼考等藥敏片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1染色鏡檢 將病料組織抹片進(jìn)行瑞特染色，鏡檢觀察細(xì)菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 無菌采集瀕死期及死亡的犢牛的肝臟、心血、肺臟，分別接種于LB血肉湯培養(yǎng)基和厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中增菌培養(yǎng)24h后，革蘭染色鏡檢，初步篩選出革蘭陽性球菌，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于LB鮮血平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)并染色鏡檢，挑選革蘭陽性球菌的單個(gè)菌落接于鮮血LB平板培養(yǎng)基分別置于37℃恒溫培養(yǎng)箱和體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行分離純化。培養(yǎng)24h后，挑選單個(gè)菌落接于鮮血LB平板和鏈球菌選擇培養(yǎng)基，置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2中培養(yǎng)，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)和溶血情況。

1.2.3生化鑒定 分離菌的生化鑒定參照文獻(xiàn)［2－3］的方法進(jìn)行。

1.2.4 分離株16SrDNA測序 將純培養(yǎng)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測定。

1.2.5 PCR鑒定

（1）引物 上游引物：GCGGTGGAGCATGTGGTT；下游引物：GTGTGACGGGCGGTGTGT。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為472bp。

（2）PCR模板 肉湯純培養(yǎng)物以12 000r／min離心10min，去上清，加200μL超純水混勻后100℃水浴10min，再冰浴2min，12 000r／min離心2 min，取上清至另一離心管中置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR反應(yīng)體系（25μL） 10×buffer 2.5 μL，2.5mmol／L dNTP 1.5μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，模板2.5 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；94 ℃ 1min，55.6 ℃ 30s，72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR結(jié)果觀察：將PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.6 動物試驗(yàn) 健康小鼠20只，分為2組，10只腹腔注射分離菌肉湯培養(yǎng)物，每只小鼠注射量為9×109cfu，另10只腹腔注射無菌生理鹽水作為對照組，每日觀察小鼠發(fā)病情況。

取健康家兔6只，4只分別耳緣靜脈注射分離株肉湯培養(yǎng)物，注射量均為18×109cfu；另2只分別耳緣靜脈注射無菌生理鹽水作對照，觀察家兔發(fā)病及死亡情況。

1.2.7 病理組織學(xué)觀察 參照文獻(xiàn)［4－5］采集發(fā)病犢牛和死亡小鼠的腦組織制作石蠟切片，HE染色，光鏡觀察其病理變化。

1.2.8 藥敏試驗(yàn) 用K－B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參考王建永等［6］的試驗(yàn)方法，依照NCCLS（美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）標(biāo)準(zhǔn)判定試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌形態(tài)觀察

病死犢牛的肺臟，肝臟和心血抹片瑞氏染色鏡檢，可見長鏈，短鏈和成對排列的球菌。病死犢牛和小鼠分離培養(yǎng)物革蘭染色呈鏈狀排列的陽性球菌，有莢膜。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性

病料接入肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，溶液變渾濁，肉肝湯培養(yǎng)基有氣體產(chǎn)生。分離菌在普通瓊脂上生長貧瘠且緩慢，在鮮血LB平板上培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)圓形白色隆起，微溶血現(xiàn)象。在鏈球菌選擇培養(yǎng)基上為白色隆起，邊緣整齊的針尖大小菌落，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2中生長良好。

2.3 生化鑒定結(jié)果

分離菌在400mL／L膽汁、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷、精氨酸中生長；在溫度為10℃和45℃時(shí)不生長，在pH 9.6、650g／L NaCl中不生長；不能利用阿拉伯糖、菊糖、棉子糖和鼠李糖。結(jié)果表明，分離株符合乳房鏈球菌的生化特性。

2.4 16SrDNA測序結(jié)果

將測序所得基因序列與GenBank上發(fā)表的序列進(jìn)行比對，同源性為98.7%。

2.5 PCR鑒定

提取分離菌的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出472bp的特異性條帶見圖1。

圖1 乳房鏈球菌特異性基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of specific gene in Streptococcus uberis

2.6 動物試驗(yàn)結(jié)果

注射分離菌后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁，消瘦，呼吸急促，靜臥不動等癥狀。小鼠在1周內(nèi)死亡5只，死亡率為50%（5／10），對照組正常，剖解死亡小鼠，腹腔有化膿性積液，積液瑞氏染色鏡檢可見大量鏈狀球菌，有莢膜。感染家兔未見死亡，但明顯消瘦。

2.7 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

病理組織學(xué)觀察結(jié)果見圖2。從圖2箭頭所指處可以看到腦組織血管擴(kuò)張充血，血管和神經(jīng)細(xì)胞外圍有較大的空隙。

圖2 犢牛腦組織石蠟切片F(xiàn)ig.2 Paraffin sections of calf brain tissue

2.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of drug sensitivity test of isolate

3 討論

目前能夠引起動物腦炎的病原有細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體、原蟲等。細(xì)菌主要有肺炎鏈球菌、腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、B族鏈球菌和奈瑟球菌等［3－4］。病毒主要有單純皰疹病毒、日本腦炎病毒、西尼羅腦炎病毒等約有一百多種病毒可致人和動物腦炎［5］。

乳房鏈球菌是導(dǎo)致規(guī)模化奶牛場乳房炎的一個(gè)重要原因，使泌乳期和非泌乳期奶牛感染臨床和亞臨床的比例增高。乳房鏈球菌被視為環(huán)境乳腺炎病原體，它已在牛場環(huán)境中無處不在，并廣泛分布，可以從墊層，草料和乳房內(nèi)及奶牛乳房外的其他部位分離到乳房鏈球菌，且其檢出率還很高［6］，說明乳房炎主要是由于環(huán)境中的乳房鏈球菌感染［7］。那么導(dǎo)致犢牛感染的乳房鏈球菌也很有可能來源于環(huán)境，或感染乳房鏈球菌的亞臨床型乳房炎奶牛的乳汁，犢牛也可能由于食用了攜帶病原體的初乳和未經(jīng)加熱處理的混合常乳而感染，有關(guān)引起犢牛感染的報(bào)道甚少。

犢牛發(fā)病主要在初冬至初春季節(jié)，據(jù)報(bào)道［8］，乳房鏈球菌能在低溫環(huán)境中存活。尤其是在寒冷季節(jié)，由于管理不當(dāng)便會促使乳房鏈球菌大量繁殖。環(huán)境中的乳房鏈球菌增加，使得犢牛感染乳房鏈球菌的機(jī)率增加。目前在全世界范圍內(nèi)，環(huán)境中的乳房鏈球菌已被報(bào)道是導(dǎo)致臨床和亞臨床乳房炎的一個(gè)主要因素［9－10］。

本試驗(yàn)中從病死犢牛的樣品的分離培養(yǎng)物和小鼠的腹腔液抹片中都可見分離株有莢膜，但分離株培養(yǎng)傳代幾代后莢膜消失。是否與分離株乳房鏈球菌發(fā)生了變異有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。在血平板培養(yǎng)基上有微溶血，這符合乳房鏈球菌的生長特性。動物接種后小鼠死亡，說明分離株有致病性。乳房鏈球菌的毒力基因主要有hasA，hasB，hasC，oppE，pauA，pauB和skc等，這些基因都與乳房炎的發(fā)生有關(guān)［11］。其中pauA基因在乳房炎病原體的致病性方面伴有相當(dāng)重要的角色［12］。上述毒力基因是否都能引起腦炎發(fā)生，或者只是其中一種基因，還需要進(jìn)一步探索研究。這將是以后深入研究乳房鏈球菌致病性的一個(gè)重要方向。

從病理組織切片中可以觀察到腦組織血管擴(kuò)張充血，血管和神經(jīng)細(xì)胞外圍有較大的空隙。這些病理性變化表明犢牛的腦組織受損，從而表現(xiàn)出腦炎癥狀。雖然乳房鏈球菌能夠到達(dá)人的眼球使人發(fā)生眼疾［13］，但是目前還沒有見到關(guān)于乳房鏈球菌具有致腦炎的特性的報(bào)道，而且它是如何通過血腦屏障的，其機(jī)理尚不清楚。

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