王海麗，葛長城，徐公義，趙德明

（1.聊城職業(yè)技術學院 聊城市畜禽疫病診療工程技術研究中心，山東聊城 252000；2.中國農業(yè)大學，北京 100193）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由豬胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種急性或慢性以肺炎和胸膜炎為特征的傳染病。該病可以通過空氣或豬之間相互接觸而傳播，近年來發(fā)病率日益增高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疾病之一［1］。APP對患豬肺部防御系統(tǒng)的破壞，使此病往往與偽狂犬病、豬藍耳病等病毒性疾病混合或繼發(fā)感染，加大疾病的危害，造成更大的損失［2］。APP共有15種血清型，且各個國家流行的優(yōu)勢血清型各不相同［3］。不同血清型間及同一血清型不同菌株的毒力由多種因素決定，包括莢膜多糖、脂多糖、轉鐵結合蛋白、脲酶和RTX毒素等［4］。

RTX（repeat in toxin，RTX）是多種革蘭陰性菌產生的一種外毒素，具有可使脂質雙層膜形成通道的特性。不同血清型的APP分別表達不同的溶血素（hemolysins）和細胞毒素（cytotoxins），即 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，都屬于細胞孔形成毒素。前3種Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保護性抗原［5］。ApxⅠ具有典型的RTX毒素單元結構特征，具有很強的溶血活性和細胞毒性，分子質量為105ku，它對豬的肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有很強的細胞毒性作用，由毒力較強的血清1、5、9、10和11型表達并分泌［6］。ApxⅡ存在于除血清10型外的所有血清型。ApxⅢ被血清2、3、4、6、8、15型分泌；所有的血清型均能分泌ApxⅣ，據(jù)稱其只在體內表達，在體外培養(yǎng)基中不能誘導其表達，故血清10型在體外培養(yǎng)只表達ApxⅠ［7］。ApxⅠ操縱子包括4個基因，分別為激活基因ApxⅠC、結構毒素基因ApxⅠA和兩個分泌必需基因ApxⅠB和ApxⅠD。有證據(jù)顯示ApxⅠA基因是位于ApxⅠN端的疏水結構，是ApxⅠ的主要抗原位點，能刺激機體產生中和保護性抗體［8］。

根據(jù)山 東 省 APP 血 清 型 特 點［9－10］，本 試 驗 以APP血清10型標準菌株天然分泌的外毒素ApxⅠ為免疫原，以血清5型ApxⅠN端1 149bp基因克隆、表達的融合蛋白為篩選抗原，研制了抗ApxⅠA單克隆抗體mAb，并對其生物學活性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞系及菌株 6周齡Balb／c純系小鼠，由上海中科院實驗動物中心提供（清潔級）；小鼠骨髓瘤細胞系（SP2／0）由中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院病理實驗室保存并傳代；APP 3、5、7、10型標準菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等菌株為聊城市畜禽疫病診療工程技術研究中心保存。APP血清10型豬陽性血清由聊城市畜禽疫病診療工程技術研究中心制備。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640為Gibco公司產品；HAT、HT為Invitrogen公司產品；PEG 1500為Roche公司產品；羊抗小鼠IgG－HRP為Promega公司產品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Gibco BRL公司產品；HAT、HT、Mab亞類鑒定試劑盒為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的提取及純化 將血清10型APP接種于含0.2mL／L NAD、50mL／L 犢牛血清、1 mmol／L CaCl2的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h（180r／min），培養(yǎng)物于4℃5 000r／min離心30 min，收集上清液。將上清緩慢加入飽和硫酸銨至60%飽和度，4℃過夜，經(jīng)4℃以5 000r／min離心30 min，收集沉淀，并用10mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7.4）溶解；通過4℃透析、超濾管濃縮、Sephadex G－200凝膠層析純化Apx I。層析液用紫外分光光度法及SDS－PAGE進行濃度、純度的鑒定。

1.2.2 基因的克隆與測序 根據(jù)GenBank登錄的ApxⅠA基因序列（AF363361），設計一對特異性引物：上游引物：5′－CCGGAATTCGAAAATGGTTTGGGAC（劃線部分為引入的EcoRⅠ的酶切位點）；下 游 引 物：5′－CCGGGATCCGAAGATTGCCTGTTTAG（劃線部分為引入的BamHⅠ酶切位點）。將PCR產物回收后克隆至載體pMD18－T中，轉化至感受態(tài)E.coli BL21。通過限制性內切酶篩選和鑒定陽性質粒，并由上海博亞生物技術有限公司進行序列測定，測定結果使用http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST 進行同源性分 析，并應用DNA Star軟件驗證其閱讀框。

1.2.3 ApxⅠA原核表達載體的構建 采用常規(guī)方法將ApxⅠA基因片段克隆至pET－32a載體中，并轉化BL21感受態(tài)細胞。對酶切鑒定的陽性質粒進行測序分析。

1.2.4 蛋白的表達、純化 選取高表達的pET－32a－apxⅠA重組體擴大培養(yǎng)［11］，IPTG 誘導目的蛋白的表達。培養(yǎng)液離心后的沉淀用PBS（pH 7.4）洗兩遍。用1／10培養(yǎng)液的PBS重懸菌體，冰浴下超聲碎菌30min（工作30s，間隔30s），于4℃12 000r／min離心15min，收集沉淀，用等體積含20 g／L十二烷基肌氨酸鈉（SKL）的 PBS（pH 7.4）重懸，震振溶解，4℃下至包涵體充分溶解后10 000 r／min離心10min，將上清轉入透析袋并加入終濃度為2g／L的PEG 4 000和終濃度為50mmol／L的氧化型谷胱甘肽與100mmol／L的還原性谷胱甘肽，用PBS（pH 8.0）4℃透析3d，每天換3次，不斷攪拌。SDS－PAGE分析重組蛋白表達情況。

1.2.5 抗原性鑒定 將純化的血清10型外毒素ApxⅠ蛋白及融合蛋白rApxⅠA進行SDS－PAGE電泳，轉化至硝酸纖維素膜上，以APP血清10型豬陽性血清為一抗，Western blot分析。

1.2.6 動物免疫 用制備的天然毒素加等量弗氏完全佐劑乳化，分多點皮下注射3只Balb／c小鼠（30μg／只～50μg／只），14d后將適量抗原加等量弗氏不完全佐劑乳化，進行第2次免疫，14d后第3次免疫。三免10d后，斷尾取血液1滴，測抗體效價。選滴度高的1只小鼠，用50μg天然毒素不加佐劑，腹腔注射加強免疫。3d～4d后，無菌取小鼠脾臟，制備免疫脾細胞懸液。

1.2.7 檢測方法的建立 采用方陣滴定法確定間接ELISA所用包被抗原和抗體的最適工作濃度。將Balb／c小鼠陽性血清和陰性血清均做倍比稀釋，確定最適工作濃度。

1.2.8 細胞融合和單克隆抗體的篩選 按文獻［12］方法制備免疫小鼠脾細胞與SP2／0細胞，融合劑采用PEG 1 500。融合過程參考文獻［13］方法進行。待融合細胞生長到培養(yǎng)孔底面積的1／3～1／2時采用間接ELISA方法篩選。選擇分泌抗體效價高、呈單個克隆生長、形態(tài)良好的雜交瘤細胞繼續(xù)克隆3次以上，直至抗體分泌陽性率達100%為止，及時液氮凍存并制備單抗腹水。

1.2.9 單克隆抗體的特異性及穩(wěn)定性鑒定

（1）間接ELISA鑒定單抗的特異性 用豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌37℃震蕩培養(yǎng)后，離心收取上清中蛋白，方法同APP外毒素的制備方法，包被ELISA板。腹水的工作濃度為1∶1 000，以間接ELISA測定4H3和11B5mAb特異性。

（2）Western blot鑒定 豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌培養(yǎng)物，加入IPTG誘導培養(yǎng)后，分別離心收集菌體裂解后進行SDS－PAGE電泳，然后用濕法將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，80 V 轉印1.5h，PBST洗膜3次，5min／次，腹水按一定濃度稀釋后作用于膜4℃過夜，洗膜同上。加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG－HRP，室溫搖床上作用2h，洗膜3次，DAB顯色。

（3）雜交瘤分泌抗體的穩(wěn)定性 對鑒定的2株陽性ApxⅠ雜交瘤細胞，分別液氮中保存細胞株。另外部分細胞傳30代以上，以間接ELISA檢測培養(yǎng)上清。細胞凍存6個月后復蘇細胞，顯微鏡下檢測細胞活性。

（4）單克隆抗體亞型鑒定 按鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒說明書鑒定Ig亞類，以OD490nm值明顯高于其他孔者，所加亞類血清判斷為單抗亞類。

2 結果

2.1 Apx IA基因序列同源性分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載APP血清1型（AF240779、X52899、X68595、U05042）、血清5型（U04954、CP000569、AF363361）、血 清 9 型（X73ll7）、血清10型 （D16582）ApxI A 基因序列，與去除酶切位點和保護性堿基的測序基因序列，進行核核酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，同豬傳染性胸膜肺炎l、5、9、10型的 ApxI A基因同源性高達98.8%～100%。

2.2 ApxⅠA重組表達質粒的構建及蛋白的表達、純化

質粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠電泳顯示，觀察到約1 049bp的目的片段，表明成功地構建了含ApxⅠA基因片段的重組表達質粒（圖1）。SDS－PAGE顯示，誘導后的重組菌在分子質量約41ku處有一清晰的新生條帶，純化后獲得了較為純的單一蛋白條帶（圖2）。

圖1 重組質粒pET－32a－apxⅠA的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET－32a－apxⅠA by enzyme digestion

2.3 ApxⅠ天然外毒素的提取

獲得的天然外毒素，經(jīng)硫酸銨純化、濃縮后，經(jīng)紫外分光光度計測定蛋白濃度為1.9mg／mL。Western blot檢測蛋白大小約105ku（圖3）。

圖2 表達產物的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of fusion protein rApxⅠA

圖3 天然外毒素SDS－PAGE分析結果Fig.3 SDS－PAGE analysis of natural outer toxin

2.4 Western blot分析

Western blot的結果顯示，提取的APP天然外毒素ApxⅠ在相對分子質量在105ku處與APP豬陽性血清發(fā)生特異性反應條帶；原核表達的融合蛋白約在41ku處與APP豬陽性血清發(fā)生特異性反應條帶，表明制備的融合蛋白具有特異性（圖4）。

2.5 雜交瘤細胞系的建立

細胞融合后5d觀察，細胞的融合率為100%，抗體檢測陽性率為51%。選擇其中4個抗體陽性的融合細胞孔細胞株進行了3～5次克隆化，最終獲得細胞陽性率為100%，分泌穩(wěn)定、形態(tài)良好的細胞株共2株。

2.6 間接ELISA檢測單克隆抗體特異性

在490nm波長下，腹水與rApxⅠA蛋白、APP 10型作用數(shù)值，明顯高于APP 3型、APP 7型、豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的數(shù)值（圖5），說明4H3、11B5兩株抗ApxⅠ單克隆抗體有良好的特異性。

圖4 蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of proteins

圖5 ApxⅠA mAb特異性檢測Fig.5 Specific detection of ApxⅠA mAb

2.7 Western blot鑒定單克隆抗體特異性

2株ApxⅠA單克隆抗體腹水與APP 3型、APP 7型、豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的裂解液沒有反應條帶，而與rApxⅠA、APP 10型分別在相對分子質量約41ku和100ku處有棕色反應條帶（圖6），表明2株單克隆抗體具有良好的反應原性。

2.8 單克隆抗體效價的測定

上述2株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體腹水效價在1∶104～1∶105；單克隆細胞株在培養(yǎng)24h且有很強的活力下，吸取培養(yǎng)上清進行測定。上清中單抗效價為1∶256～1∶512之間（表1）。表明連續(xù)傳代的雜交瘤細胞培養(yǎng)液上清中抗體效價沒有降低。

圖6 Western blot鑒定mAb特異性Fig.6 Specific detection mAb by Western blot

2.9 雜交瘤細胞系的穩(wěn)定性

上述2株雜交瘤細胞體外傳30代后，間接ELISA檢測培養(yǎng)上清中的mAb，其效價基本不變。保存于液氮中的雜交瘤細胞凍存6個月后其效價基本不變（表1），說明獲得的2株雜交瘤細胞系穩(wěn)定性好。

2.10 單克隆抗體的亞型鑒定

4H3mAb分子的亞類為IgG3；11B5mAb的分子亞類為IgG2a。

表1 單克隆抗體效價檢測Table 1 Detection titers of monoclonal antibodies

3 討論

APP溶血毒素Apx I分子質量為105ku，是分泌到APP菌體外的一類外毒素，對豬的肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有很強的細胞毒性作用，由毒力較強的血清1、5、9、10和11型表達并分泌，其中APP血清10型包括ApxⅠ和ApxⅣ兩種Apx毒素，而體外培養(yǎng)中不會產生ApxⅣ毒素［14］。本研究的制備采用APP 10型標準株體外培養(yǎng)法獲取天然ApxⅠ蛋白。Apx I分泌量相對較少，受多種因素的影響。由于APP 10型是依賴NAD的Ⅰ型，低濃度NAD的培養(yǎng)條件能夠使APP分泌更多的毒素［15］，另外，培養(yǎng)液中游離的Ca2＋可影響ApxⅠ的分泌［16］，筆者在LB培養(yǎng)液中加入0.2g／L NAD和終濃度為1mmol／L的CaCl2，在此條件下培養(yǎng)12h時Apx I的分泌量達到最大。在Apx I純化時，將Sephadex G－200凝膠過濾層析、超濾管超濾同時進行，由于超濾管具有濃縮作用，這樣較使用聚乙二醇濃縮既可以保證Apx I活性不會降低，而且也提高了樣品的純度及產量，滿足了研究的需要。

據(jù)報道，ApxⅠ的N－端蛋白免疫原性良好，可以抵抗特異性菌致死劑量的攻擊，對鼠可誘發(fā)保護性免疫，基本可以達到ApxⅠ的免疫效果。ApxⅠA位于ApxⅠ的N端，本研究構建了APP pET－32aapxⅠA表達質粒，可表達ApxⅠA融合蛋白以用于單克隆抗體的篩選，為研究ApxⅠA的生物學活性及其在疾病和疫苗免疫中的作用奠定了基礎。

在單克隆抗體制備過程中，陽性克隆的篩選選擇表達純化的融合蛋白rApxⅠA為包被抗原，采用間接ELISA檢測，避免了融合蛋白中His Tag標簽蛋白的干擾，確保了單克隆抗體的特異性。通過方陣滴定法確定了間接ELISA抗原的包被濃度與腹水的最佳稀釋度分別為1∶160（此時蛋白濃度約為50μg／mL）和1∶1 000。研制出的2株分泌抗ApxⅠA的雜交瘤細胞系經(jīng)ELISA和Western blot鑒定，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，為進一步建立豬胸膜肺炎放線桿菌檢測方法奠定了基礎。

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