陸文俊，施開創(chuàng)＊，屈素潔，莫勝蘭，李向濤，鐘 誠＊

（1.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005）

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）可以引起多種家畜、野生動物以腦炎、心肌炎及心肌周圍炎為主要特征的一種急性傳染病。EMCV可以感染人，嚙齒動物是其自然貯存宿主。斷奶仔豬感染可造成急性死亡；成年豬感染呈現(xiàn)亞臨床癥狀，偶爾出現(xiàn)豬死亡；妊娠母豬感染除了引起流產等繁殖障礙外，通常并不造成豬死亡。EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的惟一成員，病毒基因組全長約7.8kb，含有5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）、3′UTR和一個大的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。EMCV在病毒粒子形成過程中，其前體蛋白最終裂解為結構蛋白1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）、1D（VP1）和非結構蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中，結構蛋白 VP1的抗原性最強［1］。VP1蛋白刺激小鼠產生的多克隆抗體具有中和活性，可以中和EMCV在小鼠體內的感染能力，表明VP1蛋白是EMCV重要的保護性抗原［2－3］。本研究以原核表達的VP1蛋白作為包被抗原，建立了檢測EMCV抗體的間接ELISA方法，并應用于臨床血清學調查，為有效防控該病提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 EMCV VP1重組蛋白 原核表達菌株pET－32a－VP1／BL21由廣西動物疫病預防控制中心實驗室（以下簡稱本實驗室）構建，并成功表達具有良好反應原性的VP1重組蛋白［4］。經純化，獲得4.8mg／mL的VP1蛋白，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 增強型HRP－DAB底物顯色試劑盒為北京天根生化科技有限公司產品，馬血清為GIBCOBRL公司產品，脫脂奶粉為Oxiod公司產品，BSA為Solarbio公司產品；HRP－兔抗豬IgG為Sigma公司產品。

1.1.3 血清 豬抗EMCV陽性血清由本實驗室制備，F(xiàn)MDV陽性血清購自蘭州獸醫(yī)研究所；EMCV陰性血清及CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2陽性血清由本實驗室提供；待檢血清2 228份于2010年－2011年分別采自廣西14個市的中小規(guī)模豬場。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA最佳反應條件的確定

1.2.1.1 抗原包被濃度及待檢血清稀釋度的確定采用矩陣法，將倍比稀釋的重組抗原包被后，加入不同稀釋度的待檢血清，進行間接ELISA。取陽性血清OD450nm值在1.0左右，陰性血清OD450nm值小于0.25，且陽性／陰性（positive／negative，P／N）值最大的抗原濃度及待檢血清稀釋度作為最佳包被濃度及最佳稀釋度。

1.2.1.2 酶標抗體工作濃度的確定 其他條件不變，加入1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000倍稀釋的酶標抗體進行間接ELISA，確定其最佳工作濃度。

1.2.1.3 封閉液的選擇 抗原包被后，分別用含10mL／L 牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）、50mL／L馬血清、10g／L明膠、50g／L脫脂乳的PBST作為封閉液，進行間接ELISA，選擇最佳的封閉液。

1.2.1.4 待檢血清作用時間的確定 酶標板包被抗原、封閉后，加入陽性血清分別置37℃反應30 min、室溫反應30min、37℃反應45min、室溫反應45min、37℃反應60min、室溫反應60min。進行間接ELISA，確定最佳作用時間。

1.2.1.5 酶標抗體作用時間的確定 將酶標抗體按最佳稀釋度加入酶標板，分別置37℃反應30 min、室溫反應30min、37℃反應45min、室溫反應45min、37℃反應60min、室溫反應60min。進行間接ELISA，確定最佳作用時間。

1.2.1.6 底物作用時間的確定 酶標抗體作用完成后，加入單組份可溶性TMB溶液，室溫避光分別顯色10、15、20、30min。進行間接ELISA，確定最佳顯色時間。

1.2.1.7 陰性與陽性臨界值的確定 選取30份經中和試驗確定為EMCV抗體陰性的血清，按照優(yōu)化的反應條件進行間接ELISA，計算出30份血清OD450nm值的平均值（ˉX ）和標準方差（standard deviation，SD）。當被檢樣品的OD450nm值≥（ˉX＋3SD）時，判定為陽性；當樣品OD450nm值＜（ˉX＋3SD）時，判定為陰性。

1.2.2 特異性試驗 分別取 FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2的陽性血清，同時設立 EMCV陰、陽性血清對照。血清1∶40倍稀釋后，進行間接ELISA，觀察各種血清是否與重組抗原發(fā)生交叉反應。

1.2.3 廣西省EMCV感染的血清學調查 應用所建立的間接ELISA方法，對2 228份血清進行EMCV抗體檢測。主要步驟為：以pH 9.6、濃度為0.05 mol／L的碳酸鹽緩沖液做包被液，將抗原稀釋為0.625μg／mL，取100μL加入酶標板，室溫作用2h后4℃包被過夜，取出酶標板用PBST洗滌3次，每次5min；用100μL 50g／L脫脂乳于37℃封閉1h后，如上洗滌3次；加入100μL 1∶40倍稀釋的待檢血清，置37℃孵育1h后，用PBST洗滌3次；加入100μL 1∶6 000倍稀釋的兔抗豬IgG酶標抗體，37℃作用30min后，洗滌3次；加入100μL可溶性單組份TMB底物溶液，室溫避光顯色15min；以每孔50μL 2mol／L H2SO4終止反應；在酶聯(lián)檢測儀上讀取OD450nm值。當待檢血清OD450nm值≥0.33時判定為EMCV抗體陽性，當樣品OD450nm值＜0.33時判定為陰性。

2 結果

2.1 間接ELISA方法最佳反應條件的確定

表1 最佳抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定Table 1 Determination of the coating concentration of antigen and the dilution of serum samples

2.1.1 最佳抗原包被濃度及待檢血清稀釋度的確定結果見表1。當抗原濃度為0.625μg／mL、待檢血清以1∶40倍稀釋時，陽性血清OD450nm值為1.074，陰性血清 OD450nm值0.226，P／N 值最大，故確定為最佳的抗原包被濃度和待檢血清稀釋度。

2.1.2 酶標抗體最佳工作濃度的確定 結果見表2。當酶標抗體稀釋度為1∶6 000時P／N值最大，故將其作為最佳工作濃度。

表2 酶標抗體最佳工作濃度的確定Table 2 Determination of the optimal working concentration of HRP－labeled rabbit anti－porcine IgG

2.1.3 封閉液濃度的選擇 結果見表3。當以50 g／L脫脂乳作為封閉液時P／N值最大，故選其作為封閉液工作濃度。

2.1.4 待檢血清最佳作用時間的確定 結果見表4。當待檢血清在37℃反應60min時，陽性血清的OD450nm值最接近于1.0，且P／N值最大，故確定其為最佳作用時間。

2.1.5 酶標抗體作用時間的確定 結果見表5。當酶標抗體在37℃與待檢血清作用30min時，陰性血清的OD450nm值較低，陽性血清的OD450nm值接近1.0，且P／N值最大，故確定其為最佳作用時間。

表3 封閉液的確定Table 3 Determination of the blocking solution

2.1.6 底物最佳作用時間的確定 結果見表6。當TMB在室溫條件下與酶標抗體作用15min時，陰性血清的OD450nm值較低，陽性血清的OD450nm值接近1.0，且P／N值最大。因此，確定底物最佳顯色時間為室溫15min。

2.1.7 陰陽性臨界值的確定 30份陰性血清經間接ELISA方法檢測，其OD450nm值最高者為0.299，最低者為0.221。平均值（ˉX）為0.267，標準方差（SD）為0.02157，ˉX＋3SD＝0.33。因此，陰陽性血清的臨界值為0.33。當待檢血清的OD450nm值≥0.33時，判定為陽性；當待檢血清的OD450nm值＜0.33時，判定為陰性。

表4 血清最佳反應條件的確定Table 4 Determination of the optimal reacting conditions of serum samples

表5 酶標抗體最佳反應條件的確定Table 5 Determination of the optimal reacting conditions of HRP－labeled rabbit anti－porcine IgG

表6 最佳顯色時間的確定Table 6 Determination of the optimal coloration time

2.2 特異性試驗結果

特異性試驗結果見表7。EMCV VP1重組抗原與FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2陽性血清反應后，其OD450nm值均小于0.33，表明無交叉反應，特異性良好。

2.3 廣西EMCV感染的血清學調查結果

對2010年－2011年從廣西各地采集的2 228份豬血清樣品應用所建立的間接ELISA方法進行檢測，結果見表8。采自廣西14個市的豬血清樣品，陽性率最高可達100%，最低也有83.33%，平均陽性率達到91.47%，并且來自每個豬場的血清樣品均可檢出陽性樣品，豬場陽性率達到100%，表明廣西地區(qū)豬群感染EMCV非常嚴重。

表7 間接ELISA方法的特異性試驗Table 7 The specificity of the indirect ELISA

表8 廣西豬血清樣品間接ELISA檢測結果Table 8 The detection results of swine serum samples from Guangxi by indirect ELISA

3 討論

EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的成員，其結構蛋白VP1由277個氨基酸組成，在結構蛋白中的抗原性最強，可以刺激機體產生中和抗體，常是基因疫苗研究的重點區(qū)域［2－3］，也是利用基因工程技術制備診斷抗原的首選基因［5－6］。本實驗室應用原核表達載體pET－32a（＋）構建含有EMCV結構蛋白VP1基因的重組質粒，并利用大腸埃希菌成功表達了具有良好反應原性的VP1重組蛋白［4］。本研究將純化的VP1蛋白作為包被抗原，經過優(yōu)化反應條件，獲得最佳的抗原包被濃度為0.625μg／mL、待檢血清稀釋倍數(shù)為1∶40倍、酶標抗體稀釋倍數(shù)為1∶6 000倍、封閉液為50g／L脫脂乳、底物作用時間為室溫避光15min，并且重組抗原VP1與豬主要病原FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2的陽性抗體不發(fā)生交叉反應，由此成功建立了檢測豬EMCV抗體的間接ELISA方法。

間接ELISA由于其操作簡單、快速、敏感性高，而且適用于大規(guī)模的樣品檢測，成為臨床上常用的檢測方法。本研究應用所建立的間接ELISA方法、對采集自廣西各地的2 228份血清樣品進行EMCV抗體的檢測，結果被檢血清樣品的平均陽性率為91.47%，豬場陽性率為100%，表明廣西地區(qū)豬群已普遍感染EMCV。董艷嬌等［6］應用間接ELISA方法對天津市7個縣市66個豬場295份血清樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，血清樣品EMCV抗體的平均陽性率為84.75%，豬場陽性率為93.94%；張家龍等［7］應用間接ELISA方法對全國13個?。ㄊ校?6個規(guī)模豬場的3 250份血清樣品進行EMCV抗體檢測，血清樣品的平均陽性率為72%，豬場的陽性率為100%；Ge X等［8］應用中和試驗對我國14個省（市）38個規(guī)模豬場2042份血清樣品進行檢測，血清樣品EMCV抗體平均陽性率為52.45%，豬場陽性率為97.37%。與國內其他地區(qū)豬血清樣品的陽性率相比，廣西地區(qū)豬群的陽性率偏高，這可能與廣西地處亞熱帶地區(qū)，氣候炎熱、雨水豐沛、植被茂密，作為EMCV自然貯存宿主的嚙齒類動物特別是老鼠活動猖獗，與豬群頻繁接觸，從而造成了豬群的感染與傳播有關。由于鼠類是EMCV在豬群中傳播的關鍵因素［9］，也對EMCV在野生動物的感染與傳播中扮演重要角色［10］。因此，搞好環(huán)境衛(wèi)生、消滅鼠源，是防控豬腦心肌炎的一項有效措施。同時，來自廣西不同地市的豬血清樣品，其EMCV抗體陽性率沒有明顯差異，表明EMCV感染在廣西沒有明顯的地域特征，這可能與活豬大量交易、跨地區(qū)流動頻繁密切相關。

本研究利用EMCV VP1重組蛋白作為包被抗原，經優(yōu)化反應條件，成功建立了檢測EMCV抗體的間接ELISA方法，并應用該法對廣西地區(qū)EMCV感染情況進行血清學調查，為有效防控豬腦心肌炎提供了技術支持。

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