楊 莘，王建科，易 立，許紅麗，程世鵬，武 華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林吉林 132109）

細(xì)小病毒在遺傳進(jìn)化過程中，隨著病毒的基因突變以及基因重組的發(fā)生，導(dǎo)致新的病毒變異株不斷出現(xiàn)，并不斷擴(kuò)大其宿主范圍，基因重組可以改變病毒的特性和促進(jìn)適應(yīng)新的宿主。貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV）、犬細(xì)小病毒（Cannine parvovirus，CPV）、水貂腸炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）三者血清抗體彼此間有交叉反應(yīng)。FPLV在自然條件下能夠感染貓科和鼬科多種動(dòng)物，但在進(jìn)化過程中保留了一定程度的遺傳穩(wěn)定性。CPV遺傳特性、基因組特點(diǎn)與FPLV相似，推測CPV來源于FPLV或其他食肉動(dòng)物細(xì)小病毒。起初CPV－2亞型只感染犬跟犬屬動(dòng)物，并不感染貓。隨著病毒重要氨基酸的不斷變異，CPV出現(xiàn)新的變異株，導(dǎo)致病毒的宿主范圍的擴(kuò)大，能夠引起貓的感染。具有與CPV－2不同的抗原特異性的CPV－2a、CPV－2b、CPV－2c變異株在不同國家和地區(qū)相繼報(bào)道［1－6］，我國在近年也首次報(bào)道出現(xiàn)CPV－2c的感染［7］。CPV－2變異株都能夠在犬和貓之間復(fù)制、感染和傳播。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在狐貍、貉等毛皮動(dòng)物體內(nèi)也分離到CPV－2。MEV的突然出現(xiàn)并沒有一個(gè)準(zhǔn)確的定論，病毒毒力的變化以及對(duì)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大損失，使得對(duì)該病毒的認(rèn)知不斷加深。

細(xì)小病毒變異株的不斷出現(xiàn)，對(duì)細(xì)小病毒病的防控提出了嚴(yán)峻考驗(yàn)。細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要的作用；結(jié)構(gòu)蛋白VP2是病毒重要的抗原性蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)和病毒感染的過程中占主導(dǎo)地位，病毒的遺傳變異也主要體現(xiàn)在此蛋白序列中。本研究針對(duì)3種細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和結(jié)構(gòu)蛋白VP2的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)重要的氨基酸差異位點(diǎn)進(jìn)行比較。分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)小病毒不同突變毒株都具有各自的流行病學(xué)和抗原特異性，它們不僅在進(jìn)化特征上相關(guān)聯(lián)，而且對(duì)世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生造成威脅，目前病毒在野生和飼養(yǎng)的食肉動(dòng)物之間的傳播機(jī)制并不清楚。因此，開展細(xì)小病毒的流行病學(xué)調(diào)查，監(jiān)測細(xì)小病毒不同分離毒株氨基酸差異對(duì)于深入了解病毒遺傳進(jìn)化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 2010年期間在北京、吉林、遼寧等地寵物醫(yī)院、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖基地收集確定為CPV和MEV的糞便和組織樣品。

1.1.2 試劑、菌株和載體 pMD18－T 載體、LA－Taq酶、dNTPs均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；凝膠回收純化試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為Bioteke公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)所人獸共患病研究室保存。

1.2方法

1.2.1 病毒DNA的提取 各毒株DNA樣品采用Biotak DNA提取試劑盒操作手冊(cè)直接提?。喊l(fā)病動(dòng)物糞便加入PBS，制成懸液，－20℃凍融3次后，8 000r／min離心30min，取200μL上清液，加入200μL結(jié)合液CB，劇烈顛倒充分混勻后，加入20 μL蛋白酶K，混勻后70℃水浴10min后，加入100 μL異丙醇混勻；將所得溶液加入吸附柱AC中，1 0000r／min離心30s，棄掉廢液，吸附柱中加入500 μL抑制物去除液IR，1 2000r／min離心30s，加入700μL漂洗液漂洗2次后，空離2min，室溫放置5 min后，加入50μL洗脫液，室溫放置5min，12 000 r／min離心1min收集DNA，置－20℃保存。

1.2.2 引物的合成與設(shè)計(jì) 采用參考文獻(xiàn)［8］的引物E1、E2以及克隆方法擴(kuò)增細(xì)小病毒VP2蛋白全基因序列。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的水貂腸炎病毒（GenBank ID：D00765）NS1基因序列，設(shè)計(jì)合成以下一對(duì)引物，用于擴(kuò)增NS1蛋白的全長基因序列，擴(kuò)增引物預(yù)期長度為2 025bp。引物編號(hào)和序列 如 下：N1：5＇5＇－CGCGGATCCCTAACCATGTCTGG CAACC－3＇；N2：5＇－CGCTGCAGCGTACCTTAATCCAAGTCGT－3＇。 引 物 由 上 海 Invitrogen公司合成。

1.2.3 VP2、NS1全基因PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定 參照文獻(xiàn)［8］方法擴(kuò)增細(xì)小病毒VP2全基因片段。使用引物N1、N2通過PCR方法擴(kuò)增出細(xì)小病毒NS1全基因片段，采用25μL反應(yīng)體系，包括DNA提取物2μL；10×LA Taq buffer 2.5μL；dNTPs 2μL；引物 N1、N2（20mmol／L）各1μL；LA Taq DNA聚合酶0.5μL（2.5U／μL）；ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；照94℃45s，51.9℃90s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃20min后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g／L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

PCR產(chǎn)物凝膠回收純化后，按照PMD18－T載體連接操作手冊(cè)進(jìn)行T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR鑒定陽性菌落后，送Invitrogen公司測序。

1.2.4 NS1、VP2全基因推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳變異分析

（1）NS1、VP2基因同源性分析 采用DNA Star軟件對(duì)CPV、MEV不同分離株以及FPLV參考毒株的NS1和VP2基因的同源性進(jìn)行分析。

（2）重要氨基酸差異位點(diǎn)對(duì)比分析 通過Clustal W軟件對(duì)CPV和MEV分離毒株和參考毒株以及FPLV參考毒株的NS1和VP2蛋白重要氨基酸殘基差異位點(diǎn)進(jìn)行序列對(duì)比分析。

（3）NS1、VP2全基因推導(dǎo)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 采用MEGA 4軟件構(gòu)建NS1、VP2基因進(jìn)化樹，基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用bootstrap＝1 000trails驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 NS1、VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

以提取的病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增NS1基因與VP2基因。在2 075bp處均出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期基因片段大小相同（圖1和圖2）。

2.2 NS1、VP2基因的同源性分析

對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PLV、CPV、MEV不同毒株NS1基因、蛋白同源性較高，核苷酸同源性為98.7%～100.0%，氨基酸序列同源性為98.4%～100.0%；VP2蛋白基因、氨基酸同源性差異較大，核苷酸同源性為98.0%～99.9%，氨基酸序列同源性為97.1%～99.8%。

2.3 NS1、VP2基因推導(dǎo)的氨基酸差異分析

使用Clustal W對(duì)比國內(nèi)外FPLV、CPV、MEV毒株NS1基因和VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列（NS1蛋白，668aa；VP2蛋白，584aa）。FPLV、MEV 與CPV的NS1蛋白氨基酸序列在247、248、595位存在顯著的差異，但FPLV XJ－1株在這3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基與CPV相同，原因與XJ－1株的基因重組有關(guān)［9］。氨基酸差異出現(xiàn)最多的位點(diǎn)在于544、545位，F(xiàn)PLV Gln545，MEV毒株有的突變?yōu)镚lu，與CPV相同；BJ1／4／5分離株的氨基酸突變?yōu)閂al，具體原因尚不清楚。BJ1／4／5株氨基酸殘基在19、545、583位出現(xiàn)突變（Arg19、Val545、Lys583），是否這3個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)偶聯(lián)突變，有待于進(jìn)一步的研究。CPV印度分離株（AJ564427）NS1蛋白在249、282、286、436位氨基酸殘基出現(xiàn)變異（Gly249、Gly282、Glu286、Pro436），這些突變可能為該病毒特有的突變位點(diǎn)。CPVnj／01／06分離株氨基酸在597、598、599、600 位 出 現(xiàn) 特 異 的 突 變 （His597、Val598、Arg599、Met600）。同時(shí)，采用CBS Prediction Serv－ers軟件對(duì)NS1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明，NS1蛋白的各氨基酸突變并沒有出現(xiàn)在蛋白磷酸化位點(diǎn)上。

CPV與FPLV、MEV的VP2蛋白氨基酸殘基在80、93、103、323、564、568位存在差異，同時(shí)這幾個(gè)位點(diǎn)也是區(qū)分CPV與FPLV、MEV的重要氨基酸位點(diǎn)；CPV－2、FPLV、MEV與其他 CPV 突變株（CPV－2a／2b／2c 及 其 CPV－2a／2b 突 變 株 ）在 87、298、300、305位氨基酸殘基存在差異；CPV－2VP2蛋白同其他CPV亞型相比，在101位氨基酸為Ile，而其他亞型突變?yōu)闉門hr，同時(shí)這個(gè)位點(diǎn)在FPLV和MEV VP2蛋白中也出現(xiàn)突變。VP2蛋白Asn375氨基酸只在CPV－2中出現(xiàn)。CPV、FPLV、MEV出現(xiàn)氨基酸差異最多的位點(diǎn)出現(xiàn)在300位和426位，這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)在細(xì)小病毒遺傳進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，對(duì)我國CPV分離毒株序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，我國CPV分離株Ile324氨基酸突變位點(diǎn)仍然存在，同時(shí)在我國分離的其他CPV亞型中，也存在此位點(diǎn)的突變［8］，是否為我國CPV流行毒株的典型特點(diǎn)有待于進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查。BJ1／4／5株VP2氨基酸蛋白267、440位出現(xiàn)突變（Tyr 267、Ala440），440 位 突 變 與 印 度 分 離 株（AJ56447）相同，此位點(diǎn)是否導(dǎo)致CPV流行病學(xué)差異目前無法確定。MEV VP2蛋白氨基酸僅在300位存在較大差異，同時(shí)有的MEV毒株在232位突變?yōu)榕cCPV相同的氨基酸（Ile232）。MEV－Z6株在236位氨基酸出現(xiàn)突變（Ser236）。

圖1 CPV、MEV NS1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NS1genes of CPV and MEV

圖2 CPV、MEV VP2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of VP2genes of CPV and MEV

2.4 基于細(xì)小病毒NS1和VP2蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 4軟件，對(duì)5株細(xì)小病毒分離毒株以及GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)小病毒參考毒株的NS1和VP2蛋白的氨基酸序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3，圖4）。雖然FPLV、CPV、MEV及其各個(gè)亞型間的NS1氨基酸序列比較保守，但在遺傳進(jìn)化過程中仍出現(xiàn)明顯的分支界限。FPLV、MEV與CPV形成兩大分支。FPLV XJ－1分離株，由于其病毒基因發(fā)生重組，NS1基因來源于CPV，因此出現(xiàn)在CPV譜系中［9］。細(xì)小病毒VP2氨基酸序列可分為CPV－2b、CPV－2c、CPV－2a和MEV、FPLV兩大譜系。分析發(fā)現(xiàn)，本研究中分離的CPV同屬于CPV－2a亞型（Asn426，Val555）。我國CPV北京分離株BJ－1／4／5株與印度分離株（AJ564427）在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上非常接近，提示我國分離株同印度分離株有著極其緊密的關(guān)系。BJ6株同 CPVnj／01／06株、B－2004株單獨(dú)成為一簇。水貂腸炎病毒MEV－Z6分離株與MEV－DL拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常接近，其VP2蛋白重要氨基酸殘基上沒有差異，只存在個(gè)別的散在突變。FPLV、CPV、MEV的VP2基因在進(jìn)化過程中目前并沒有出現(xiàn)基因交叉重組的現(xiàn)象。

NS1和VP2蛋白氨基酸遺傳進(jìn)化樹對(duì)比發(fā)現(xiàn)，NS1和VP2蛋白在病毒遺傳進(jìn)化過程中，CPV均形成自己的一個(gè)大的分支。雖然NS1蛋白氨基酸保守性較高，但在遺傳進(jìn)化過程中也形成了獨(dú)立的分支，并沒有同F(xiàn)PLV、MEV形成交叉分支（FPLV XJ－1除外）。我們可以推斷，病毒基因重組的概率不大。并且由于NS1蛋白在病毒在復(fù)制過程中的重要作用，決定了其在病毒進(jìn)化過程中的保守性，病毒在NS1蛋白調(diào)節(jié)下進(jìn)行復(fù)制的過程中，為適應(yīng)不同宿主細(xì)胞，在病毒的衣殼蛋白基因中出現(xiàn)了突變，導(dǎo)致病毒抗原性出現(xiàn)差異，使得病毒VP2蛋白氨基酸在進(jìn)化分支上形成不同的亞型分支。CPV北京分離株（BJ1／4／5／6）以及我國其他分離株 NS1和 VP2蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，可能目前二者在遺傳進(jìn)化上具有一定的相似性，分離株中二者在重要氨基酸位點(diǎn)同其他參考毒株沒有大的差異；NS1蛋白遺傳進(jìn)化過程中較為穩(wěn)定，但主要抗原蛋白VP2出現(xiàn)與NS1蛋白相同的進(jìn)化特點(diǎn)，提示可能目前我國犬細(xì)小病毒在遺傳進(jìn)化過程中處于穩(wěn)定的狀態(tài)，并沒有出現(xiàn)大的變異。

BJ1－6.CPV北京分離株；MEV－Z6.MEV吉林分離株BJ1－6.CPV－2Beijing isolate；MEV－Z6.MEV Jilin isolate

圖4 細(xì)小病毒VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of parvovirus VP2gene

3 討論

FPLV、CPV、MEV主要感染食肉動(dòng)物，同屬細(xì)小病毒屬的成員，它們?cè)谒拗魈禺愋苑矫骐m有一定的限制，但隨著病毒的遺傳變異，宿主范圍出現(xiàn)了較大的變化。犬細(xì)小病毒具有高度變異性，病毒亞型經(jīng)歷了由 CPV－2到 CPV－2a／2b以及 CPV－2c的變異，宿主范圍由單一的犬群擴(kuò)大到貓等其他哺乳動(dòng)物，并且在猴子中出現(xiàn)了FPLV感染［10］。MEV目前只能引起水貂發(fā)病，但也能感染浣熊、狐貍、臭鼬等，并無其他動(dòng)物發(fā)病死亡的報(bào)道。同源分析發(fā)現(xiàn)，各細(xì)小病毒間NS1蛋白同源性較高，VP2蛋白氨基酸同源性差異較大。氨基酸序列對(duì)比和遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)小病毒各種屬以及各個(gè)亞型之間NS1蛋白磷酸化位點(diǎn)并沒有出現(xiàn)突變；VP2蛋白氨基酸位點(diǎn)差異出現(xiàn)最多的在于CPV，而FPLV、MEV在進(jìn)化過程中出現(xiàn)差異概率較小，可見，CPV的遺傳進(jìn)化速度較快。研究表明，VP2基因核苷酸序列每年每 個(gè) 位 點(diǎn) 突 變 率 為 10－4［11］，遠(yuǎn) 高 于 FPLV 和MEV。本研究中，CPV分離毒株均屬于CPV－2a亞型，VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列表明，之前報(bào)道的CPV VP2氨基酸序列中的獨(dú)特的Ile324位突變，在北京分離株中也存在，同時(shí)在我國分離的其他CPV亞型中，也存在此位點(diǎn)的突變［8］，是否為我國CPV流行毒株的典型特點(diǎn)有待于進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查。BJ1／4／5株同印度株單獨(dú)構(gòu)成一簇，其Ala440位氨基酸出現(xiàn)突變，此位點(diǎn)是否導(dǎo)致CPV流行病學(xué)差異目前無法確定。

通過細(xì)小病毒NS1和VP2蛋白氨基酸之間差異對(duì)比，能夠從分子水平上監(jiān)測病毒在不同宿主間的遺傳變異。不同病毒亞型的出現(xiàn)以及病毒跨種間的傳播，均是由病毒重要抗原蛋白上的氨基酸突變所引起的。目前已經(jīng)證實(shí)，CPV－2b同CPV－2a相比，VP2蛋白氨基酸殘基出現(xiàn)Asp426的變異；CPV－2a／2b與 CPV－2a／2b 突 變 株 則 出 現(xiàn) 300Asp氨基酸變異，此位點(diǎn)突變株首先報(bào)道于越南的貓?bào)w內(nèi)，隨后在犬體內(nèi)也出現(xiàn)了此氨基酸位點(diǎn)突變株［12］；CPV－2b與CPV－2c出現(xiàn)氨基酸 Glu426的變異，這些提示這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)在病毒遺傳進(jìn)化過程中具有重要作用。CPV各亞型間VP2蛋白氨基酸在80（R）、93（N）、103（A）、323（N）、564（S）、568（G）位氨基酸一致，但與FPLV、MEV有差異。對(duì)細(xì)小病毒氨基酸差異位點(diǎn)功能研究表明［13－14］，CPV VP2蛋白氨基酸序列93、103、323位氨基酸位點(diǎn)對(duì)于病毒能夠在犬中復(fù)制起重要作用；而FPLV VP2蛋白氨基酸序列中，80、564、568位氨基酸對(duì)于病毒在貓中的復(fù)制是必須的。新的抗原類型CPV－2a和CPV－2b，能夠感染貓，主要由 VP2蛋白87、300、305位氨基酸位決定。而在MEV中，氨基酸差異出現(xiàn)最多的位點(diǎn)也在300位這個(gè)位置。同時(shí)，NS1基因中存在核苷酸的無義突變。限制性酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，MEVB毒株NS1基因中存在Cla I酶切位點(diǎn)，其他MEV分離毒株以及CPV、FPLV毒株中均未出現(xiàn)此酶切位點(diǎn)，同時(shí)氨基酸以及磷酸化位點(diǎn)分析表明，此位點(diǎn)的出現(xiàn)并沒有導(dǎo)致氨基酸位點(diǎn)的突變，也并非NS1蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

控制細(xì)小病毒病的傳播主要靠疫苗免疫的方法。新的病毒突變株不斷出現(xiàn)，對(duì)疫苗的保護(hù)效力提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。因此，針對(duì)不同細(xì)小病毒毒株間NS1蛋白和VP2蛋白間的氨基酸差異的監(jiān)測，對(duì)于掌握病毒感染的發(fā)生、發(fā)展與流行的基本規(guī)律以及病毒主要流行毒株的亞型提供理論基礎(chǔ)，對(duì)研究細(xì)小病毒的生物學(xué)特性、疫苗保護(hù)水平的評(píng)估等具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

［1］Chinchkar S R，Mohana Subramanian B，Hanumantha Rao N，et al.Analysis of VP2gene sequences of canine parvovirus isolates in India［J］.Arch Virol，2006，151（9）：1881－1887.

［2］Martella V，Cavalli A，Pratelli A，et al.A canine parvovirus mutant is spreading in Italy［J］.J Clin Microbiol，2004，42（3）：1333－1336.

［3］Parrish C R.Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones［J］.Virology，1991，183（1）：195－205.

［4］Hirayama K，Kano R，Hosokawa－Kanai T，et al.VP2gene of a canine parvovirus isolate from stool of a puppy［J］.J Vet Med Sci，2005，67（1）：139－143.

［5］Wang H C，Chen W D，Lin S L，et al.Phylogenetic analysis of canine parvovirus VP2gene in Taiwan［J］.Virus Gen，2005，31（2）：171－174.

［6］Buonavoglia C，Martella V，Pratelli A，et al.Evidence for evolution of canine parvovirus type 2in Italy［J］.J Gen Virol，2001，82（Pt12）：3021－3025.

［7］張仁舟，楊松濤，馮 昊，等.中國國內(nèi)首次檢測到犬細(xì)小病毒CPV－2c［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2010，5（4）：246－249.

［8］易 立，程世鵬，閆喜軍，等.犬細(xì)小病毒VP2基因的遺傳變異分析［J］.病毒學(xué)報(bào)，2009，25（6）：452－459.

［9］Ohshima T，Mochizuki M.Evidence for recombination between feline panleukopenia virus and canine parvovirus type 2［J］.J Vet Med Sci，2009，71（4）：403－408.

［10］Yang S，Wang S，F(xiàn)eng H，et al.Isolation and characterization of feline panleukopenia virus from a diarrheic monkey［J］.Vet Microbiol，2010，143（2－4）：155－159.

［11］Hoelzer K，Shackelton L A，Parrish C R，et al.Phylogenetic analysis reveals the emergence，evolution and dispersal of carnivore parvoviruses［J］.J Gen Virol，2008，89（Pt 9）：2280－2289.

［12］Kang B K，Song D S，Lee C S，et al.Prevalence and genetic characterization of canine parvoviruses in Korea［J］.Virus Genes，2008，36（1）：127－133.

［13］Truyen U，Evermann J F，Vieler E，et al.Evolution of canine parvovirus involved loss and gain of feline host range［J］.Virology，1996，215（2）：186－189.

［14］Parrish C R.Host range relationships and the evolution of canine parvovirus［J］.Vet Microbiol，1999，69（1－2）：29－40.