沙依蘭古麗，汪 萍，巴特力，陸桂麗，成 進(jìn)

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以禽類消化道、呼吸道損傷為主要特征的急性高度接觸性傳染病。該病呈世界范圍分布，給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。我國采取以免疫為主的綜合防控措施，在一定程度上控制了新城疫大規(guī)模流行，但該病仍然是目前危害我國禽類的重大傳染病之一，并且呈現(xiàn)許多新的流行病學(xué)特點，如非典型性新城疫、新城疫病毒新基因（亞）型出現(xiàn)，宿主范圍擴(kuò)大和毒力增強(qiáng)等對新城疫防控帶來了一定的困難。

NDV屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬［1］?；蚪M大小約為15kb，由L、NP、P、HN、F、M等6種特異性結(jié)構(gòu)蛋白組成［2］，其中F蛋白具有使病毒脂蛋白囊膜與宿主細(xì)胞膜融合的功能，參與病毒的穿入過程。根據(jù)NDV F糖蛋白基因的序列變異情況，有人將NDV劃分成不同的基因型，并認(rèn)為F蛋白結(jié)構(gòu)功能變化與NDV致病性密切相關(guān)［3］。目前NDV只有一種血清型，但研究表明NDV不同毒株之間的抗原性差異正在逐漸加大，再加上生產(chǎn)中新城疫疫苗的使用頻繁且混亂，導(dǎo)致近些年ND出現(xiàn)不同的流行特點和新的毒株的出現(xiàn)。我們于2008年從新疆烏魯木齊市郊區(qū)個體專業(yè)養(yǎng)禽場的發(fā)病雞群中分離到兩株雞源NDV強(qiáng)毒，并對其F基因進(jìn)行了克隆、基因序列測定及遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株來源與背景 2株NDV強(qiáng)毒株均從新疆烏魯木齊市郊區(qū)個體專業(yè)養(yǎng)雞場發(fā)病雞群中分離獲得，毒株編號與背景見表1。

表1 NDV新疆分離毒株背景Table 1 The number and background of NDV isolated from Xinjiang

1.1.2 菌種和載體 E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本研究室自備，克隆載體PGEM－T為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑與工具酶 RT－PCR試劑盒（One Step RNA Extaction Kit）、IPTG、X－gal、EX Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖袨镻romega公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與血凝（HA）效價測定 將分離毒株適當(dāng)稀釋后，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚（0.1mL／胚），37℃孵育，收集24h后死亡胚尿囊液，按常規(guī)微量檢測法檢測血凝效價，置－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的NDV強(qiáng)毒F基因序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計兩對特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

引物 1：F1：5′－ATG GGC TCC AAA CCT TCT AC －3′；F2：5′－TTG TAG TGG CTC TCA TC－3′。

引物 2：F1：5′－ATG GGC TCC AAA CCT TCT AC －3′；F2：5′CGG CTG ACT CTG TGT TCA GAT T－3′。

1.2.3 RNA的提取 吸取250μL的含毒雞胚尿囊液，按照Trizol LS Reagent試劑盒的使用說明書進(jìn)行操作，最后用20μL 1mL／L DEPC處理的滅菌去離子水洗脫溶解RNA。

1.2.4 RT－PCR擴(kuò)增 取5μL提取的核酸做模板，直接用于 RT－PCR擴(kuò)增。RT－PCR程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃5min；94℃40s，55℃ 30s，72℃2min，循環(huán)35次；最后在72℃延伸10min。取RT－PCR產(chǎn)物4μL用10g／L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.5 F基因的克隆與鑒定 切下PCR產(chǎn)物中含有目的片段的瓊脂糖凝膠，按Promeg公司的凝膠純化試劑盒說明書進(jìn)行回收。把所得的RT－PCR純化產(chǎn)物連接于pGEM－T Easy載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有24mg／mL IPTG、50mg／mL X－gal和10mg／mL Ampinicillin的LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日平板置于4℃2h充分顯色，挑取白色菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r／min搖床培養(yǎng)10h。按質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR快速鑒定，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.6 F基因核苷酸及氨基酸序列的分析 利用DNA Star 6.1軟件對新疆分離的2株NDV F基因的核苷酸和氨基酸序列與GenBank具有代表性的參考毒株進(jìn)行同源性比較分析，繪制基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR 擴(kuò)增

用設(shè)計的特異性引物成功擴(kuò)增出大小約1.6 kb的目的片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 F基因的RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of RT－PCR products of F gene

2.2 F基因的克隆與PCR鑒定

挑取白色菌落培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒為模板，用上述一對特異性引物分別進(jìn)行PCR快速鑒定，結(jié)果均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的約1 600bp基因，表明F基因已成功克隆到PGEM－T Easy載體上。

2.3 F基因序列測定與分析結(jié)果

將獲得的陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，獲得的2株NDV新疆分離株的F基因核苷酸序列和編碼的氨基酸序列符合NDV病毒F基因序列長度，氨基酸裂解位點與 NDV 強(qiáng)毒株的特征相符，均為112R－R－Q－K－RF117；在氨基酸序列101位和121位的氨基酸為賴氨酸（K）和纈氨酸（V），為基因Ⅶ NDV強(qiáng)毒株的特征性氨基酸（表2和表3）。

2.4同源性分析

應(yīng)用DNA Star分析軟件對2株NDV毒株與國內(nèi)外不同基因型毒株以及疫苗毒株之間的核苷酸序列進(jìn)行了同源性比對。結(jié)果顯示，新疆NDV／XJ／10／08毒株與 NDV／XJ／17／08之間的同源性為98.5%；這2個毒株與國內(nèi)外流行的基因Ⅶ型強(qiáng)毒株之間的同源性在87.4%～98.2%，其中與NDV基因Ⅶd亞型毒株的同源性較高在94.4%～98.2%；與現(xiàn)用基因Ⅱ和基因Ⅲ型疫苗毒株（clone 30、B1、LaSota、Mukteswar 等 ）之 間 的 同 源 性81.8%～84.2%，與其他Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ等基因型毒株同源性在84.6%～86.5%（表4和表5）。

表2 NDV新疆分離株的F基因核苷酸長度、編碼的多肽長度和氨基酸裂解位點序列Table 2 The nucleoide length，polypeptides length and the sequence of amino acid of F gene of NDV Xinjiang isolates

表3 NDV新疆分離株的F基因氨基酸序列及裂解位點序列Table 3 The amino acid sequence and cleavage site sequence of F gene

表4 本文中參考的NDV毒株Table 4 NDV strains used in polygenetic analyses

表5 NDV新疆分離株與國內(nèi)外參考株F基因核苷酸序列同源性比較Table 5 The nucleotide homology analysis of F gene between Xinjiang strains and reference strains

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用DNA Star軟件將新疆分離的2株NDV毒株F基因核苷酸序列與國內(nèi)外參考毒株F基因核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并繪制了其系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。從圖中可以看出，新疆分離的NDV／XJ／10／08和 NDV／XJ／17／08 毒 株 的 親 緣 關(guān) 系 很近，與這幾年國內(nèi)流行的Ⅶd同源性較高，都在同一分支上；而與 Clone 30、La Sota、B1、Mukteswar等疫苗毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

本研究對2株雞源NDV新疆分離株的F基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)2個NDV分離株同源性為98.5%，與國內(nèi)外流行的基因Ⅶ型強(qiáng)毒株之間的同源性為87.4%～98.0%，其中與國內(nèi)流行的基因Ⅶd亞型毒株（GenBank登陸號：FJ882014、FJ608335、FJ80805）的同源性較高，在97.4%以上；與現(xiàn)用疫苗毒株（clone 30、B1、LaSo－ta、Mukteswar等）同源性較低，在81.8%～84.2%之間；與NDV其他 （Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ）基因型毒株同源性也低，在84.6%～91.2%之間。

NDV毒株分成9個基因型，其中I～Ⅵ是早已存在的老基因型，Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ為新發(fā)現(xiàn)的基因型，其中NDV基因Ⅶ型為強(qiáng)毒株，分為Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅶd、Ⅶe型等 5 個 基 因 亞型［7－9］。我國目前流行的NDV主要基因為Ⅶ型，但也存在Ⅲ 、Ⅸ 、Ⅵ等其他基因型散發(fā)，基因Ⅶ型NDV所占的比重呈逐年上升的趨勢，其中基因Ⅶd亞型毒株占的比例超過60%［10－12］。本研究分析表明，2個 NDV 新疆分離株均屬于基因Ⅶ型強(qiáng)毒株，其中與近年來國內(nèi)流行的基因Ⅶd亞型毒株的遺傳距離很近，均屬于NDV基因Ⅶd亞型毒株；與傳統(tǒng)的疫苗株clone 30、Bl、La Sota和Mukteswar的遺傳距離較遠(yuǎn)，這可能是現(xiàn)有ND疫苗免疫后不能形成有效保護(hù)的一個重要原因。

圖2 NDV新疆分離株與國內(nèi)外參考株F基因核苷酸之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree analysis of F gene between Xinjiang strains and reference strains

F基因是NDV感染細(xì)胞所必需的主要結(jié)構(gòu)蛋白［4－5］，它可以促進(jìn)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，從而使病毒穿入細(xì)胞漿脫去核衣殼進(jìn)行復(fù)制，毒力不同的NDV毒株F基因序列不同，其差異主要集中在F基因的裂解區(qū)，強(qiáng)毒株裂解區(qū)的氨基酸序列為112R－R－Q－K／R－R－F117，而弱毒株為112G－K／R－QG／S－R－L117［6］。本研究對2個NDV 新疆毒株F基因裂解位點區(qū)的氨基酸序列分析表明，NDV／XJ／10／08和 NDV／XJ／17／08株與強(qiáng)毒株 F基因裂解區(qū)的氨基酸序列相符，屬于強(qiáng)毒株。

研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)疫苗免疫雞群并不能阻止NDV強(qiáng)毒的感染和排毒，但是HI抗體水平很高時，可以減輕雞群臨床癥狀、降低死亡率和發(fā)病率，也就是臨床上的非典型性新城疫。因此，傳統(tǒng)的弱毒疫苗免疫并不能完全消除新城疫的發(fā)生，反而會引起新城疫原性的變異，導(dǎo)致新城疫免疫失敗和非典型性ND的發(fā)生。同時，弱毒株在疾病的傳播中所起的作用也不能忽略，隨著新城疫的繼續(xù)演化可能會出現(xiàn)新的基因亞型和變異株［13－17］。因此，應(yīng)密切關(guān)注生產(chǎn)中NDV抗原性的變化，篩選與當(dāng)前NDV流行株密切相關(guān)的毒株作為候選疫苗株配合常規(guī)疫苗免疫，才能更好地控制新城疫的流行。

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