張 芳，董 海，岳 旺

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)系、2.附屬醫(yī)院(東區(qū))重癥醫(yī)學(xué)科，山東青島 266021)

MES 23.5細(xì)胞是由大鼠中腦細(xì)胞與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤－膠質(zhì)瘤細(xì)胞株18TG2經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)形成的一種DA能細(xì)胞株，具有中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的許多特性，它含有酪氨酸羥化酶，能夠合成DA(多巴胺)，但不合成其他兒茶酚胺［1］。氧是需氧生物生存的基本要素，但同時(shí)也是生成有害的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的前體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，ROS生成能力超過清除能力或外源ROS大量涌入體內(nèi)時(shí)，氧化應(yīng)激便產(chǎn)生了。這是包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的50多種疾病的一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制［2］。H2O2是眾多種類ROS中最重要的一種，H2O2憑借其良好的細(xì)胞膜滲透性可以輕易的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性［3］。故本實(shí)驗(yàn)我們選用H2O2造成MES 23.5細(xì)胞的損傷模型進(jìn)行研究。

2，3-吲哚醌(2，3-indolinedione，isatin，ISA)，又名靛紅，是近年發(fā)現(xiàn)存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)源性活性因子，具有多種生物學(xué)活性。先前我們?cè)诙喾N動(dòng)物模型證實(shí)ISA可提高腦內(nèi)DA含量［4］，減輕大鼠6-OHDA損毀模型的旋轉(zhuǎn)行為，同時(shí)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化［5］和抑制腫瘤生長(zhǎng)［6］的作用，這些作用與提高細(xì)胞的抗氧化作用有密切關(guān)系。本文采用MTT、FCM和LSCM方法測(cè)定了ISA預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的MES 23.5細(xì)胞△ψm和［Ca2+］i水平，以進(jìn)一步深入探討ISA保護(hù)細(xì)胞的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)MES 23.5細(xì)胞由美國(guó)休斯敦貝勒醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科友情饋贈(zèng)。用含5%胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)基(均購(gòu)自美國(guó) GIBCO-BRL公司)，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下，于鋪被了多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，美國(guó));倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó));酶標(biāo)儀(雷杜公司，深圳);流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，美國(guó))，激光掃描共聚焦顯微鏡(OX-81，Olympus，日本)。

1.3 MTT檢測(cè)

1.3.1不同濃度H2O2對(duì)MES 23.5細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MES 23.5細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成6×108cells·L－1的細(xì)胞懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同稀釋度的H2O2(5、10、20、40、80 和 160 μmol·L－1)，以新鮮配制的DMEM/F12培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。

培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入5 g·L－1的MTT 20 μl，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入DMSO 200 μl，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(主波長(zhǎng)494 nm，次波長(zhǎng)630 nm)，測(cè)定其吸光度值。并計(jì)算各組MES 23.5細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/陰性對(duì)照組吸光度均值×100%。

1.3.2不同濃度ISA對(duì)MES 23.5細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

按上述方法測(cè)定不同濃度 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對(duì) MES 23.5 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3不同濃度ISA對(duì)H2O2造成MES 23.5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用相同方法測(cè)定不同濃度ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對(duì) 20 μmol·L－1H2O2造成MES 23.5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.4FCM檢測(cè)△ψm將MES 23.5細(xì)胞懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的6孔板中，每孔2 ml。24 h后各孔分別加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培養(yǎng)液作陰性對(duì)照。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

測(cè)定△ψm:培養(yǎng)結(jié)束前30 min，棄上清，每孔加入5 mg·L－1的 R 123，37℃避光負(fù)載 30 min，HBS吹打制成單細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾后加入流式細(xì)胞儀的樣品室，以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)523 nm測(cè)定，F(xiàn)CS/SSC設(shè)門，收集門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞，CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細(xì)胞R 123的熒光強(qiáng)度。

FCM分析各組細(xì)胞R 123的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為101設(shè)門，低于101為M1區(qū)，高于101為M2區(qū)，M1區(qū)的細(xì)胞認(rèn)為是△ψm降低，受損細(xì)胞所占比例，M2區(qū)的細(xì)胞為正常細(xì)胞所占比例。

1.5LSCM測(cè)定［Ca2+］iMES 23.5細(xì)胞懸液接種于放置了玻片并鋪有多聚賴氨酸的24孔板中。24 h 后各孔分別加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培養(yǎng)液作陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前45 min，每孔加入 Fluo-3/AM 50 μl，37℃ 避光負(fù)載 45 min后將玻片放置于LSCM測(cè)定小室內(nèi)，由488 nm激發(fā)，檢測(cè)各組細(xì)胞發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的熒光強(qiáng)度。以Fluoview 5.0圖像處理系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，各組間率的比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)結(jié)果5，10 μmol·L－1的 H2O2作用于MES 23.5細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞存活率無影響，20 μmol·L－1及以上濃度的H2O2處理組，細(xì)胞的存活率降低(P＜0.01)，且至 160 μmol·L－1范圍內(nèi)，表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。由此在本實(shí)驗(yàn)中使用20 μmol·L－1的H2O2造成MES 23.5細(xì)胞損傷模型。

單獨(dú)使用不同濃度的 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對(duì)細(xì)胞存活率無影響。25 及50 μmol·L－1ISA處理的MES 23.5細(xì)胞存活率與單獨(dú)H2O220 μmol·L－1處理組相比，差異無顯著性，ISA 100、200和400 μmol·L－1處理的細(xì)胞存活率均較單獨(dú)H2O220 μmol·L－1組有明顯升高(P＜0.01，P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Protective effect of different concentration of ISA on the viability of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.2FCM檢測(cè)△ψm結(jié)果20 μmol·L－1H2O2與MES 23.5細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，M1區(qū)細(xì)胞所占比例平均為28.8% ±5.4%，表明28.8%的細(xì)胞△ψm降低，而對(duì)照組為21.3% ±3.3%，兩者之間差異明顯(P＜0.05);20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組，M1區(qū)細(xì)胞所占比例平均為20.1% ±3.2%，比H2O2處理組明顯降低(P＜0.01)，完全恢復(fù)到正常水平(Fig 2B)。

MES 23.5 細(xì)胞經(jīng)20 μmol·L－1H2O2孵育 24 h后，平均熒光強(qiáng)度為30.0±3.5，較對(duì)照組明顯降低(46.7 ± 5.3，P＜ 0.01)。20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組平均熒光強(qiáng)度為 43.0 ±4.7，較單獨(dú)使用H2O2組明顯增強(qiáng)(P＜0.01，F(xiàn)ig 2C)。

Fig 2A Protective effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure)

Fig 2B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cells

Fig 2C Effect of ISA 100 μmol·L －1on the R 123 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.3LSCM檢測(cè)［Ca2+］i結(jié)果20 μmol·L－1H2O2組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(160.3±48.9)與對(duì)照組(57.3±13.5)相比明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，表明經(jīng)H2O2孵育后MES 23.5細(xì)胞的［Ca2+］i明顯升高;20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組，熒光強(qiáng)度為83.0±8.2，比H2O2組明顯降低(P＜0.01，F(xiàn)ig 3B)。

3 討論

ISA為吲哚類衍生物，是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性生物活性物質(zhì)［7］，且廣泛存在于海洋生物如龍蝦和十字花科植物如板藍(lán)根、甘藍(lán)等［8］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用 25 μmol·L－1至 400 μmol·L－1的ISA對(duì)細(xì)胞存活率無明顯影響，而將一定濃度的ISA加入H2O2損傷的MES 23.5細(xì)胞后，使存活率增高，表明ISA能拮抗H2O2對(duì)MES 23.5細(xì)胞造成的損傷。

△ψm是由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子的不對(duì)稱分布而形成的電位差，為維持線粒體正常功能所必需。在細(xì)胞受損傷早期，由于線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)換管孔 (permeability transition pore，PTP)開放，使膜通透性增加，△ψm下降。△ψm的變化可利用能選擇性被線粒體所吸收的熒光染料——R 123來測(cè)定，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化反映△ψm變化，檢測(cè)出早期受損傷的細(xì)胞［9］。生理情況下PTP周期性開放，以維持線粒體內(nèi)電化學(xué)平衡，保持氧化還原通路的暢通。細(xì)胞凋亡過程中，PTP不可逆性開放，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失，△ψm降低，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯(lián)，最終引起細(xì)胞凋亡［10］。本實(shí)驗(yàn)20 μmol·L－1H2O2組 MES 23.5 細(xì)胞的 R 123吸收值明顯低于對(duì)照組，且△ψm降低的細(xì)胞所占比例明顯增高，即△ψm已發(fā)生異常改變。多種原因均能誘導(dǎo)PTP的開放，其中高濃度Ca2+和ROS尤為重要［11］。

Fig 3A Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure，40 × )

Fig 3B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity in H2O2-treated MES 23.5 cells

維持細(xì)胞內(nèi)低濃度的Ca2+是細(xì)胞正常與否的一個(gè)重要標(biāo)志，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超負(fù)荷是導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死的重要因素［12］。大量ROS可破壞細(xì)胞膜，造成膜通透性增加從而使Ca2+內(nèi)流增加。ROS還可損傷線粒體膜，導(dǎo)致ATP生成減少，抑制鈣泵活性;ROS損傷肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，影響Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，加劇細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載［13］。

本實(shí)驗(yàn) 20 μmol·L－1H2O2孵育 MES 23.5 細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度明顯升高，表示MES 23.5 細(xì)胞［Ca2+］i升高;100 μmol·L－1的 ISA處理后，細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度較H2O2處理組明顯降低，表示 ISA處理降低了 MES 23.5細(xì)胞［Ca2+］i水平。

線粒體對(duì)Ca2+的攝取和釋放在胞質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)中起重要作用。當(dāng)［Ca2+］i升高時(shí)，線粒體代償性攝入Ca2+。Ca2+的攝入常伴隨線粒體膜的去極化和H+的排出，還有線粒體內(nèi)Ca2+濃度的增加，當(dāng)Ca2+攝入過量時(shí)，這些因素均促使線粒體內(nèi)膜PTP開放，其結(jié)果線粒體膜對(duì)離子通透性升高，Ca2+流入胞質(zhì)，△ψm降低和氧化磷酸化的脫偶聯(lián)［14］。

在使用了ISA后，減輕了H2O2對(duì)MES 23.5細(xì)胞造成的損傷。該保護(hù)作用主要通過ISA的抗氧化作用，降低了［Ca2+］i水平，減少PTP的開放，△ψm降低減輕。

本實(shí)驗(yàn)中研究的ISA對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用以及對(duì)其可能機(jī)制的初步探討，為DA系統(tǒng)功能失調(diào)相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供新的可能方案，為這一海洋活性物質(zhì)的新用途和進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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