楊 光，閆 琳，高進(jìn)賢，易正洪，蔣袁絮

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750004;2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

氧化槐定堿(oxysophoridine，OSR)是從苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)中提取的主要生物堿之一［1］。本室前期研究發(fā)現(xiàn)OSR在熱板和福爾馬林兩種致痛模型中均具有一定的鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛作用部位涉及中樞和外周［2］。側(cè)腦室注射OSR能明顯增加大鼠皮層、海馬γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，下調(diào)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體(GABA transporter-1，GAT-1)的基因表達(dá)［3-4］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討OSR(iv)的鎮(zhèn)痛作用以及GABAA受體在OSR鎮(zhèn)痛中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物昆明種小鼠，♀♂ 兼用，體質(zhì)量18～22 g，寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔合格證號(hào):SCXK(寧)2005-001〕。小鼠分籠飼養(yǎng)，溫度20～22℃，相對(duì)濕度50% ～60%，光照明暗各12 h。

1.2藥品及試劑OSR:寧夏紫荊花藥業(yè)公司，批號(hào):071217;鹽酸嗎啡注射液(morphine，Mor):沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)051106，使用前均用生理鹽水溶解，置4℃冰箱備用。多克隆羊抗GABAARα1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號(hào):J0509;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG:北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號(hào):86531;辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG(H+L):北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號(hào):86531。

1.3主要儀器和設(shè)備DK-420S型三用恒溫水箱;上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;100LAP/SPLIT MENMORY電子秒表:日本;凝膠成像儀:美國(guó)Bio-RAD公司;高速低溫離心機(jī):美國(guó) Bio-RAD公司;SDSPAGE電泳儀:美國(guó)Bio-RAD公司;轉(zhuǎn)移電泳儀:美國(guó)Bio-RAD公司;實(shí)時(shí)定量PCR儀:美國(guó)Bio-RAD公司;DYY-Ⅲ電泳儀:北京六一儀器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1溫浴法痛閾測(cè)定依照Luttinger［5］關(guān)于溫浴法測(cè)定的描述進(jìn)行操作，于給藥后 10、20、30、45、60、90min測(cè)定痛閾變化，并按下式計(jì)算痛閾提高率。

2.2給藥方法及分組小鼠50只，♀♂ 兼用，隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(NS組);陽(yáng)性對(duì)照組(Mor 40.0 mg·kg-1)和 OSR(500.0，250.0，125.0 mg·kg-1)組，每組10只。除嗎啡采用腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)外，其余均為 iv，容量為 0.1 ml/10 g，空白對(duì)照組給予等容量NS。分別測(cè)定各組給藥前、后小鼠甩尾潛伏期。

2.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)GABAARα1基因小鼠42只，♀♂兼用，按取材部位不同分為脊髓組和腦組。脊髓組小鼠21只，隨機(jī)分成3組，每組7只:空白對(duì)照組(NS)、模型對(duì)照組(福爾馬林，F(xiàn)ormalin)、OSR組。Formalin組和OSR組分別給予NS(0.1 ml/10 g，iv)和 OSR(500.0 mg·kg-1，iv)35 min 后，小鼠足下注射 2%Formalin 20 μl，30 min取脊髓(腰膨大)。腦組小鼠分組及給藥同脊髓組，3 h 取腦(去小腦);常規(guī) RNA 提取，0.067 mol·L-1瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA質(zhì)量后用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用TransStart Green qPCRSuperMix試劑盒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以基因相對(duì)表達(dá)量為指標(biāo)檢測(cè)OSR對(duì)Formalin致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA表達(dá)的影響，GABAARα1和內(nèi)參引物 GAPDH均依據(jù) NCBI GenBank中小鼠GABAARα1和GAPHD基因序列號(hào)由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成，基因序列如下:GABAARα1:(f):5'CAAGTCTCCTTCTGGCTCAAC3';(r):5'TTTACTGTGGCAAACTCAATC3';產(chǎn)物長(zhǎng)度:200 bp;退火溫度:52。GAPDH:(f):5'AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG3';(r):5'AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度:294 bp;退火溫度:52。

2.4Western blot法檢測(cè)GABAARα1蛋白動(dòng)物分組及給藥同“2.3”，1.5 h 取脊髓、4 h 取腦(去小腦)，RIPA裂解液提取蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定蛋白質(zhì)含量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(300 mA，90 min)，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，多克隆羊抗GABAARα1抗體(1∶600)，4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次后加上辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶3 000)4℃孵育3 h，PBST次洗膜3次后，利用Western blot熒光試劑(Ecl)進(jìn)行化學(xué)曝光，按標(biāo)準(zhǔn)程序顯影、沖洗膠片，采用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)對(duì)圖片上每個(gè)特異條帶進(jìn)行掃描分析，得出目的條帶面積灰度值。以目的蛋白的灰度值比內(nèi)參GAPDH的灰度值校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白相對(duì)含量。以蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)OSR對(duì)Formalin致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達(dá)的影響。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用形式表示，各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析選用方差分析(One-way ANOVA)和t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1OSR對(duì)小鼠熱甩尾痛閾的影響Mor(40 mg·kg-1，ip)可使小鼠熱甩尾潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，作用持續(xù)90 min以上。與給藥前及NS組比較，OSR(500、250 mg·kg-1，iv)能明顯延長(zhǎng)小鼠熱甩尾潛伏期(P＜0.05、P＜0.01)，鎮(zhèn)痛作用可持續(xù)60 min以上，最大痛閾提高率可達(dá)59.82%(Tab 1)。

3.2OSR對(duì)福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1mRNA表達(dá)的影響

3.2.1紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度及純度所抽提的RNA光密度(OD)值A(chǔ)260/280均在1.8到2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)3條明顯的RNA 特征條帶:5 S、18 S、28 S，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 特異性強(qiáng)、質(zhì)量好，GAPDH和GABAARα1定量PCR產(chǎn)物熔解曲線峰值均一、在反應(yīng)曲線的其它位置未見(jiàn)到明顯波形(Fig 1～3)。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA in brain and spinal cord

Fig 2 Cumulative results of GAPDH and GABAARα1(n=7)

Fig 3 Solubility curve of GAPDH and GABAARα1(n=7)

3.2.2OSR對(duì)福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA表達(dá)的影響與 Formalin組比較，OSR(500.0mg·kg-1，iv)可明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)的GABAARα1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)，提高小鼠脊髓和腦 GABAARα1 mRNA表達(dá)(P＜0.01)(Fig 4)。

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs pre-dose

NS 3.49 ±0.83 3.30 ±1.16 3.54 ±1.39 3.63 ±1.25 3.83 ±1.71 3.72 ±2.20 3.27 ±1.14 Mor 40.0 3.44 ±1.07 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 14.5 ±0.96＊＊##OSR 500.0 3.49 ±0.87 7.02 ±1.01＊＊##10.38 ±1.44＊＊##9.47 ±1.54＊＊##8.11 ±1.40＊＊##7.27 ±1.92＊＊##3.25 ±0.81 250.0 4.08 ±1.68 4.08 ±1.69 7.82 ±1.85＊＊##7.72 ±1.90＊＊##6.37 ±1.92＊＊##5.23 ±2.68*# 4.18 ±1.50 125.0 3.37 ±0.89 4.08 ±1.17 3.64 ±1.11 4.23 ±1.31 4.44 ±1.64*#4.07 ±1.73 3.23 ±0.78

Fig 4 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 mRNA expression measured by quantitative real-time PCR(±s，n=7)

3.3OSR對(duì)福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達(dá)的影響與Formalin組比較，OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可使小鼠脊髓和腦GABAARα1蛋白表達(dá)量明顯提高(P＜0.01)，提示OSR可明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)的GABAARα1蛋白表達(dá)量的下調(diào)(P＜0.01)(Fig 5～7)。

Fig 5 Agarose gel electrophoresis result of GABAARα1 protein expression in spinal cord

4 討論

Fig 6 Agarose gel electrophoresis results of GABAARα1 protein expression in brain

Fig 7 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 Protein expression measured by Western blot(±s，n=7)

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于痛覺(jué)傳導(dǎo)通路上，通過(guò)與GABAA受體結(jié)合而開(kāi)放其偶聯(lián)的氯離子通道，胞外氯離子內(nèi)流增加使膜超極化，產(chǎn)生抑制性突觸后電位，進(jìn)而引起包括鎮(zhèn)痛在內(nèi)的多種中樞抑制作用［6～8］。電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明 GABA作用于 GABAA受體通過(guò)影響大鼠伏核中痛興奮神經(jīng)元和痛抑制神經(jīng)元的放電活動(dòng)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［9］，由GABAA受體介導(dǎo)的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元GABA激活電流(IGABA)能被GABAA特異性拮抗劑荷包牡丹堿(Bicuculline，BIC)阻斷［10］。在脊髓以上水平有大量的GABA能神經(jīng)元，它們?cè)诳箓π源碳ず痛賯π源碳ぶ杏兄匾饔?。GABA介導(dǎo)的神經(jīng)元活動(dòng)在中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)(PAG)和延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核群(RVM)的固有神經(jīng)環(huán)路中可調(diào)節(jié)從PAG和RVM發(fā)出的內(nèi)源性痛覺(jué)下行抑制系統(tǒng)的功能，而GABAA受體參與了其對(duì)內(nèi)源性痛覺(jué)下行抑制系統(tǒng)復(fù)雜的調(diào)控作用。在大鼠的RVM或PAG給予GABAA受體興奮劑或拮抗劑可產(chǎn)生抗傷害或促傷害性刺激作用(即致痛敏作用)［11］。脊髓是接受疼痛信息的初級(jí)中樞，也是中樞對(duì)傷害性信息進(jìn)行加工處理的重要部位，傳遞傷害性信息的Aδ類(lèi)纖維和C類(lèi)纖維多終止于此。GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓各層面都有表達(dá)，其中脊髓Ⅰ、Ⅲ層密度最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［12］均顯示福爾馬林所致疼痛刺激可改變脊髓GABAA受體基因和蛋白表達(dá)，提示GABA受體系統(tǒng)在感覺(jué)和痛覺(jué)過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用。有研究表明，脊髓GABA能神經(jīng)元的減少會(huì)減弱調(diào)節(jié)痛覺(jué)的抑制性信號(hào)的傳導(dǎo)，從而使痛覺(jué)傳導(dǎo)通路上脊髓神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，引起神經(jīng)痛。而神經(jīng)痛早期給予GABAA受體激動(dòng)劑，可減少異位放電向中樞傳遞，預(yù)防神經(jīng)痛發(fā)生，提示GABAA受體激動(dòng)劑作用于受損大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)對(duì)神經(jīng)痛有一定的抑制效果［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 OSR(500.0、250.0 mg·kg-1，ith)能明顯延長(zhǎng)小鼠熱甩尾潛伏期(P＜0.05、P＜0.01)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可改善福爾馬林所致小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA和蛋白表達(dá)的減少 (P＜0.05，P＜0.01)。以上結(jié)果提示OSR具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，小鼠脊髓和腦GABAARα1受體上調(diào)是OSR鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制之一。關(guān)于中樞GABA能神經(jīng)參與OSR鎮(zhèn)痛作用的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］鐘仁山.苦豆子的研究應(yīng)用［M］.銀川:寧夏人民出版社，1985:10-20.

［1］Zhong R S.Research and Application of Sophora alopecuroidles L.［M］.Yinchuan:Ningxia People's Publishing House，1985:10-20.

［2］姚婉霞，周俊俊，閆 琳，等.氧化槐定堿鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究［J］.中草藥，2008，39(4):569-71.

［2］Yao W X，Zhou J J，Yan L，et al.Analgesic effect of oxysophoridine and its mechanism［J］.Chin Trad Herbal Drugs，2008，39(4):569-71.

［3］余建強(qiáng)，蔣袁絮.槐定堿對(duì)大鼠中樞谷氨酸及氨基丁酸免疫陽(yáng)性細(xì)胞的影響［J］.中藥藥理與臨床，2006，10(19):1611-4.

［3］Yu J Q，Jiang Y X.The effects of sophoridine on the positive cells Glu and GABA immunoreactions in CNS of rats［J］.Pharmacol Clin Chin Mater Med，2006，10(19):1611-4.

［4］高進(jìn)賢，陶麗君，余建強(qiáng)，等.氧化槐定堿鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)小鼠中樞PKCγ表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(11):1453-6.

［4］Gao J X，Tao L J，Yu J Q，et al.The analgesic action of oxysophoridine and its effect on the expression of PKCγ in central nervous system of mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11):1453-6.

［5］Luttinger D.鎮(zhèn)痛藥物實(shí)驗(yàn)法［M］//徐叔云，卞如濂，陳 修，主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:695-9.

［5］Luttinger D.Analgesic drug experimentation［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，Chief ed.Pharmacology experiment methodology.2ed edition.Beijing:People’s Medical Publishing House，1991:695-9.

［6］Rudolph U，M?hler H.GABA-based therapeutic approaches:GABAAreceptor subtype functions［J］.Curr Opin Pharmacol，2006，6(1):18-23.

［7］Mirza N R，Munro G.The role of GABA(A)receptor subtypes as analgesic targets［J］.Drug News Perspect，2010，23(6):351-60.

［8］Michels G，Moss S J.GABAAreceptors:properties and trafficking［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2007，42(1):3-14.

［9］許 艷，徐滿英.伏核注射γ-氨基丁酸對(duì)大鼠伏核痛反應(yīng)神經(jīng)元放電的影響［J］.中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(6):349-53.

［9］Xu Y，Xu M Y.Effects of γ-aminobutyric acid injected into nucleus accumbens on the electric activities of pain-related neurons in the nucleus accumbens in rats［J］.Chin J Pain Med，2005，11(6):349-53.

［10］周 瑩，劉長(zhǎng)金，李 愛(ài)，等.大麻素對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元γ-氨基丁酸激活電流的抑制作用［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，36(5):561-6.

［10］Zhou Y，Liu C J，Li A，et al.Inhibition of GABA-activated currents by cannabinoids in rat trigeminal neurons［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2007，36(5):561-6.

［11］王擒云，楊建平，馮昌棟，戴體俊.延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核群的GABAA受體部分介導(dǎo)丙泊酚在中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏作用［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(5):907-14.

［11］Wang Q Y，Yang J P，F(xiàn)eng C D，Dai T J.Partial Mediation Effect of GABAAreceptor in the rostral ventromedial medulla on propofol-induced Hyperalgesia at ventrolateral portion of the periaqueductal gray of rats［J］.Suzhou Univ J Med Sci，2010，30(5):907-14.

［12］孟 春，王國(guó)林，梁 禹.γ-氨基丁酸及其受體在大鼠脊髓疼痛傳導(dǎo)通路中的表達(dá)［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(16):2416-20.

［12］Meng C，Wang L G，Liang Y.Expression of GABA and its receptors in spinal dorsal horn of painful rats［J］.Chin J Mod Med，2010，20(16):2416-20.

［13］余開(kāi)峰，李穎波，冉 然.γ-氨基丁酸及其受體在慢性神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)及意義［J］.湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(1):5-7.

［13］Yu K F，Li Y B，Ran R.Significance and expression of γ-GABA and its receptor in dorsal root ganglion of rats with neuropathic pain［J］.J Hubei Univ Med，2011，30(1):5-7.

［14］程 偉，文 靜，戴體俊，季 永.GABA的鎮(zhèn)痛、催眠、遺忘作用及其與GABAA受體的關(guān)系［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(6):757-61.

［14］Cheng W，Wen J，Dai T J，Ji Y.Relationship between GABAAreceptor and the analgesic、hypnotic and amnesic effects induced by GABA［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):757-61.