孫傳菊，李 霞，趙懿清，袁鳳來，吳繁榮，陳飛虎

(1.南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 無錫 214041;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

骨骼作為運(yùn)動(dòng)中的動(dòng)力器官，處在一個(gè)不斷修復(fù)和重建過程。骨破壞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)和骨質(zhì)疏松造成患者功能障礙等諸多臨床問題的重要原因［1］。目前造成代謝性骨破壞的機(jī)制仍未完全闡明，但破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)在其中的作用已被大量的研究所證實(shí)［2］，尤其是免疫系統(tǒng)在破骨細(xì)胞功能方面的研究進(jìn)展，催生了骨免疫這一概念，并在此框架下取得了一系列研究成果［3－4］。

免疫細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞在骨破壞中的調(diào)控發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)［2］，細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基(ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)在破骨細(xì)胞增殖、分化、活化和存活等一系列生理過程中起十分關(guān)鍵的作用。此外，白細(xì)胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-17以及IL-7等細(xì)胞因子在破骨細(xì)胞增殖與分化等過程中發(fā)揮正調(diào)控作用［5］。除對(duì)破骨細(xì)胞正調(diào)控作用的免疫分子外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)是一群具有免疫抑制效應(yīng)的T細(xì)胞亞群，對(duì)破骨細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用，其調(diào)節(jié)功能在機(jī)體免疫自穩(wěn)、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應(yīng)及微生物感染方面均得到了證實(shí)［6］。由于其對(duì)破骨細(xì)胞的增殖與活化具有抑制功能，近年來備受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)［7－8］，RA患者體內(nèi)循環(huán)Tregs與患者局部和全身骨質(zhì)破壞呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)RA患者體內(nèi)Tregs細(xì)胞，能夠阻止或延緩患者的骨質(zhì)破壞。

因此，本文就近年來有關(guān)Tregs及其在骨破壞研究中的進(jìn)展情況作一綜述，以期加深對(duì)骨破壞發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為抗骨破壞的治療進(jìn)一步打下基礎(chǔ)。

1 Tregs的分類和來源

Tregs在體內(nèi)外具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能，根據(jù)Tregs表面標(biāo)記、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和作用機(jī)制的不同，Tregs可分為自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Tregs(nTregs)細(xì)胞，在胸腺外誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞 (iTregs)兩類［9－10］。

1.1自然產(chǎn)生的Tregs細(xì)胞近年來研究得較為清楚的亞型為CD4+CD25+Tregs細(xì)胞。研究證實(shí)［11］，nTregs細(xì)胞在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織中，約占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%。對(duì)nTregs來源，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD4+T細(xì)胞是在胸腺自然選擇過程中產(chǎn)生的，其分化由T細(xì)胞受體(TCR)與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞的MHC-Ⅱ類肽復(fù)合物或胸腺內(nèi)皮細(xì)胞遞呈的外周自身抗原肽間的高親和力結(jié)合所誘導(dǎo)。nTregs在胎兒及新生兒早期CD4+T細(xì)胞發(fā)育過程中已有一定活性，細(xì)胞膜表達(dá)不同的TCR，具有識(shí)別各種抗原的能力［12］。在成人階段，一些nTregs分化記憶CD4+T細(xì)胞，因此，即使胸腺隨年齡增長(zhǎng)而逐漸萎縮，但nTregs數(shù)量仍能保持在一定范圍［13］。nTregs的免疫抑制性表現(xiàn)在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號(hào)刺激活化以后能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。

CD25(IL-2受體α鏈)是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個(gè)原始細(xì)胞表面標(biāo)記［14］，此外，隨著研究的深入，新的Tregs細(xì)胞表面標(biāo)記不斷被發(fā)現(xiàn)，研究提示糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族(glucocorticoid-induced TNF factor receptor-related family，GITR)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、CD127(IL-7受體)、神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp1)可能為 Treg 重要的表面分子標(biāo)志物［15］。Foxp3基因?qū)儆贔oxhead(forkhead box P3)轉(zhuǎn)錄因子家族，是細(xì)胞內(nèi)分子。近年來的研究證明［16］，F(xiàn)oxP3對(duì)Tregs的生長(zhǎng)及抑制功能均起關(guān)鍵作用，因此，F(xiàn)oxP3這一細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物對(duì)Tregs的鑒別有重要意義。

1.2誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tregs細(xì)胞誘導(dǎo)型Tregs則由外周CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原或細(xì)胞因子刺激后表達(dá)CD25而生成。iTregs細(xì)胞能夠有效抑制其它T細(xì)胞的活化和增殖，而這些抑制作用可能是通過其分泌的IL-10和TGF-β等免疫抑制因子實(shí)現(xiàn)的［17］。到目前為止，根據(jù)iTregs分泌細(xì)胞因子的不同，將其分為Tr1(type 1 regulatory)和Th3(T-helper 3)兩個(gè)主要亞基。Tr1主要分泌IL-10，而Th3主要分泌TGF-β，對(duì)Th1和Th2都具有抑制作用［18］。iTregs除表達(dá)FoxP3細(xì)胞內(nèi)分子，還表達(dá)CD4、CD25、CTLA-4和GITR等細(xì)胞外分子。

2 Tregs對(duì)破骨細(xì)胞功能的抑制作用

破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一吸收骨的多核細(xì)胞，它來源于造血細(xì)胞，經(jīng)血液循環(huán)被招募到骨，在骨的微環(huán)境中分化為具有所有成熟破骨細(xì)胞表型的單核破骨細(xì)胞前體，然后融合成多核細(xì)胞。近期研究發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞是RA和骨質(zhì)疏松的骨破壞的關(guān)鍵，在骨破壞病灶部位有大量成熟OC及OC前體，活性淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種起正調(diào)控作用的細(xì)胞因子，作用于OC生成、分化、活化和存活各個(gè)環(huán)節(jié)，使OC過度增殖或異?；钴S，打破了骨代謝的平衡，骨破壞占據(jù)優(yōu)勢(shì)［19］。而負(fù)調(diào)控作用的免疫分子如Tregs細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收也有抑制作用［20－22］。

Zaiss等［7］研究發(fā)現(xiàn) Tregs細(xì)胞呈劑量依賴性抑制M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其抑制破骨細(xì)胞形成是通過自身細(xì)胞表面分子CTLA-4發(fā)揮作用的。此外，在體外用Tregs細(xì)胞能抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能。Kim等［6］研究發(fā)現(xiàn)人血清中的Tregs抑制破骨細(xì)胞增殖與活化不是通過其細(xì)胞表面分子，而是自身分泌抑制性細(xì)胞因子IL-4和TGF-β。免疫磁珠方法分離其自身T細(xì)胞，在體外共同培養(yǎng)，并加入抗CD28和抗CD23抗體，增加Tregs細(xì)胞的生成，分化的破骨細(xì)胞明顯減少，分泌的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、干擾素 γ (IFN-γ)、IL-5 和 IL-10 明顯增加，從而免疫抑制破骨細(xì)胞增殖與活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)將以上純化的Tregs注入膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠關(guān)節(jié)，明顯抑制脾細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞。羅成燕等［21］研究發(fā)現(xiàn)Tregs源性IL-10與TGF-β1具有對(duì)破骨細(xì)胞分化及骨吸收的抑制作用。以上研究顯示Tregs可能成為抑制破骨細(xì)胞增殖與活化的作用靶點(diǎn)。

3 Tregs在抗骨破壞中的應(yīng)用

目前有關(guān)RA的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，主要有CIA和抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(antigen-induced arthritis，AIA)兩類。Morgan 等［24］在研究小鼠CIA中發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ型膠原免疫前除去小鼠Treg，小鼠CIA的發(fā)生率將大大提高，其疾病嚴(yán)重程度包括骨破壞也更高，而選擇性回輸Tregs細(xì)胞則可逆轉(zhuǎn)CIA小鼠的病情。Zaiss等［25］將Foxp3轉(zhuǎn)基因小鼠來源的骨髓細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)至TNF轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF轉(zhuǎn)基因小鼠的骨質(zhì)破壞幾乎被全部阻斷;而Foxp3基因敲除小鼠來源的骨髓細(xì)胞則能夠加快TNF轉(zhuǎn)基因小鼠的骨質(zhì)破壞，其作用是Tregs直接抑制關(guān)節(jié)炎中破骨細(xì)胞的生成。在另一種實(shí)驗(yàn)小鼠模型(人TNF轉(zhuǎn)基因小鼠)，給予CD28超拮抗性單克隆抗體(CD28 superagonist antibodies，CD28 SA)，能夠刺激上調(diào)Foxp3的Tregs細(xì)胞數(shù)量，也能夠明顯抑制實(shí)驗(yàn)小鼠的骨質(zhì)破壞(Fig 1)。在上述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，由于破骨?xì)胞前體細(xì)胞分化受阻，破骨細(xì)胞數(shù)量的減少，是Tregs抑制骨質(zhì)破壞的主要原因。

Fig 1 Anti-CD28 superagonist antibody in the suppression of bone destruction

最近在骨質(zhì)疏松的研究中發(fā)現(xiàn)［26］，過表達(dá)Foxp3的淋巴細(xì)胞，明顯增加Tregs細(xì)胞數(shù)量，能明顯增加骨形成而抑制去卵巢誘導(dǎo)的骨破壞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，向淋巴細(xì)胞缺乏的RAG1基因敲除小鼠注入CD4+CD25+Tregs細(xì)胞直接抑制破骨細(xì)胞的形成和功能從而增加骨量和抑制骨破壞，不依賴于分泌其它抑制性細(xì)胞因子。

4 展望

總之，當(dāng)前的研究表明Tregs細(xì)胞主要是通過抑制破骨細(xì)胞的功能而抗骨破壞。盡管目前對(duì)體內(nèi)外Tregs細(xì)胞都已進(jìn)行了廣泛的研究并取得了重大進(jìn)展，但關(guān)于Tregs的作用機(jī)制和免疫生物學(xué)特性以及其在骨破壞中確切的作用，尚未取得無爭(zhēng)議的結(jié)論，因而仍需作更深入的研究。Tregs細(xì)胞在誘導(dǎo)抑制破骨細(xì)胞中的作用是肯定的，但是其確切的抑制骨破壞的作用機(jī)制，以及在臨床使用中的安全性等問題，仍有待于深入的研究。不同的研究策略誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞增殖的效力還需進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，對(duì)這些問題的深入研究將有利于在臨床使用中對(duì)Tregs細(xì)胞進(jìn)行可靠的控制。我們完全有理由相信，隨著研究的不斷深入，必將使我們對(duì)骨破壞的發(fā)病機(jī)制有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)［27］，并有可能使Tregs在治療RA和骨質(zhì)疏松等骨破壞方面取得新的突破。

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