梁 惠，劉 穎，韓 磊，賀 娟，張文卿，馬愛國

(1.青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021;2.青島大學醫(yī)學院細胞與分子生物學實驗室，山東青島 266071;3.青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，山東青島 266003;4.青島大學醫(yī)學院病原生物學實驗室，山東 青島 266071)

肝癌是嚴重危害人類生命健康的頑癥之一。近年來，海洋萜類化合物的天然抗氧化、抗腫瘤活性已引起人們的廣泛關(guān)注［1］。凹頂藻是海洋萜類化合物的重要來源，課題組前期已從三列凹頂藻中成功獲得總萜含量為63.3%的凹頂藻萜提取物，并進行一系列體內(nèi)外實驗，獲得了可喜的研究結(jié)果［2－4］。但目前關(guān)于凹頂藻萜類化合物對 H22腫瘤p53和MMP-9表達及氧化應(yīng)激水平的影響，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本實驗以凹頂藻萜提取物為干預(yù)物，觀察其對小鼠H22腫瘤的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及瘤株清潔級昆明小鼠，18～23 g，♂，由青島市實驗動物中心提供。H22小鼠肝癌細胞株，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所引進。

1.2主要試劑凹頂藻萜提取物(LTE)，為本實驗室所有;兔抗小鼠突變型p53抗體、MMP-9抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司);免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);SOD及MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);

1.3動物模型的建立40只昆明小鼠隨機分為模型組、LTE低、中、高劑量干預(yù)組。于小鼠左前肢腋窩皮下接種2×109·L－1的H22肝癌細胞懸液0.2 ml。24 h后，模型組給予大豆色拉油0.5 ml·d－1灌胃;LTE低、中、高劑量干預(yù)組給予大豆色拉油稀釋的 LTE 溶液 25、50、100 mg·kg－1·d－10.5 ml灌胃;各組均連續(xù)給藥2周，觀察小鼠生長情況。

1.4樣品采集末次給藥24 h后，小鼠腹主動脈取血，肝素抗凝，用于抗氧化指標檢測。完整剝離腫瘤，計算抑瘤率。抑瘤率/%=(對照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5LTE對小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達的影響取上述各組小鼠新鮮腫瘤組織常規(guī)做石蠟切片，按照SP免疫組化試劑盒說明書操作。

1.6LTE對H22小鼠血漿過氧化指標的影響按照試劑盒說明書操作。

1.7LTE對紅細胞溶血度的影響采用比色法檢測。

1.8統(tǒng)計學處理使用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1實驗小鼠成瘤情況模型組小鼠腫瘤生長潛伏期(TT)短，2 d即可成瘤，且生長迅速。與模型組比較，LTE各劑量組小鼠TT達到3～4 d，腫瘤生長緩慢。各組小鼠成瘤率為100%。

2.2LTE對H22小鼠腫瘤質(zhì)量的影響模型組小鼠腫瘤質(zhì)量較大，達到(2.68±0.86)g;LTE各組小鼠H22腫瘤生長均明顯受到抑制，分別達到(1.94±0.52)、(1.74±0.65)和(1.56±0.44)g，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。且隨著藥物劑量的增加，抑瘤率逐漸升高，分別達到27.5%、34.9%和41.4%，具有量效依賴趨勢。

2.3LTE對小鼠H22腫瘤組織中突變型p53和MMP-9表達的影響LTE高劑量組突變型p53和MMP-9陽性細胞表達率下降，與模型組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

Tab 1 Effect of LTE on expression of p53 and MMP9 in H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d －1 Positive rate/%p53 MMP-9 Model 9 0.00 42.5 ±1.31 75.1 ±2.68 LTE 9 25.00 35.6 ±1.69 65.9 ±1.52 8 50.00 30.1 ±1.74 42.6 ±1.36*7 100.00 20.8 ±0.64* 32.5 ±0.83*

2.4LTE對H22小鼠血漿過氧化指標的影響LTE高劑量組SOD酶活力明顯升高，而中、高劑量組MDA含量則減少，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。見Tab 2。

2.5LTE對H22小鼠紅細胞溶血度的影響中、高劑量組紅細胞溶血度明顯下降，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

Tab 2 Effect of LTE on hemolytic degree and SOD and MDA in serum of H22 mice(±s)

*P＜0.05 vs model group

Group n Dose/mg·kg－1·d－1 hemolytic degree/%Model 9 0.00 28.87 ±3.17 57.98 ±4.16 14.52 ±5.67 SOD/kU·L－1 MDA/μmol·L －1 LTE 9 25.00 35.01 ±5.84 45.22 ±8.81 11.42 ±6.63 8 50.00 42.95 ±7.23 32.39 ±6.16* 7.57 ±3.34*7 100.00 57.13 ±6.38* 24.85 ±3.68* 6.40 ±2.16*

3 討論

突變型p53蛋白是腫瘤組織所特有的標志蛋白，檢測該基因蛋白在腫瘤組織中的表達情況是反映腫瘤生長狀況的一個重要指標［5］。MMP-9又稱明膠酶B(gelatinase-B)，檢測腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達情況對評價藥物對腫瘤的治療效果具有重要意義［6］。本實驗結(jié)果顯示，LTE干預(yù)組腫瘤生長普遍被抑制，同時，其p53和MMP-9蛋白的表達水平明顯下降。表明LTE可通過下調(diào)p53和MMP-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達，限制腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，抑制小鼠H22腫瘤組織生長。

大量研究證實，腫瘤患者可通過多種途徑引發(fā)氧化應(yīng)激，而提高SOD、GSH等抗氧化劑的表達水平及活性，可明顯抑制腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。H2O2是活性氧的一種，通常被用于誘導(dǎo)紅細胞溶血，以檢測紅細胞膜抗氧化能力［7］。本實驗結(jié)果顯示，一定劑量的LTE可明顯提高H22荷瘤小鼠血漿中SOD酶活力，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，減少H2O2誘導(dǎo)的紅細胞溶血。表明LTE具有較強的抗氧化活性，可有效阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，這可能也是LTE抑制H22腫瘤生長的另一機制。

總之，凹頂藻萜類化合物作為一種海洋天然活性物質(zhì)，可有效抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長，值得進一步開發(fā)利用和深入探索。

［1］Cheung F W，Li C，Che CT，et al.Geoditin A induces oxidative stress and apoptosis on human colon HT29 cells［J］.Mar Drugs，2010，8(1):80 －90.

［2］董春景，梁 惠，賀 娟，馬愛國.海藻萜類化合物對二甲基苯蒽誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌的抑制作用［J］.營養(yǎng)學報，2007，29(2):197－8.

［2］Dong C J，Liang H，He J，Ma A G.The Antitumor effects of laurencia terpenoids extract on breast carcinoma induced by DMBA in rats［J］.Acta Nutr Sin，2007，29(2):197 －8.

［3］劉 穎，梁 惠，蘇 愛，等.海兔素對人胃癌細胞 SGC-7901增殖和凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):333－7.

［3］Liu Y，Liang H，Su A，et al.Effect of aplysin on the proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell SGC-7901［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):333 －7.

［4］劉 穎，梁 惠，徐宏偉，等.海兔素對S180荷瘤小鼠的抑瘤活性及其免疫作用的實驗觀察［J］.中國藥理學通報，2006，22(11):1403－5.

［4］Liu Y，Liang H，Xu H W，et al.Anticancer activities and imm unologic function of Aplysin［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1403－5.

［5］Acun T，Terzioglu-Kara E，Konu O，et al.Mdm2 Snp309 G allele displays high frequency and inverse correlation with somatic p53 mutations in hepatocellular carcinoma［J］.Mutat Res，2010，684(1－2):106－8.

［6］Ahmad A，Kong D，Wang Z，et al.Down-regulation of uPA and uPAR by 3，3'-diindolylmethane contributes to the inhibition of cell growth and migration of breast cancer cells［J］.J Cell Biochem，2009，108(4):916 －25.

［7］Acharya A，Das I，Chandhok D，Saha T.Redox regulation in cancer:a double-edged sword with therapeutic potential［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(1):23－34.