郭鳳，孫威，姚陽，高青華，閔冬雨，封瑞，胡慧媛，蔡際群，郝麗英

（1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽 110001；2.沈陽醫(yī)學(xué)院生理教研室，沈陽 110034）

海馬是癲癇的重要致癇病灶之一，其CAl與CA3區(qū)錐體神經(jīng)元是癇性放電的初始位點［1］。研究表明，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在無鎂細胞外液的作用下可形成異常放電，而異常放電的作用機制并不清楚。離子通道結(jié)構(gòu)和功能的障礙均可引起癇性發(fā)作，而電壓依賴性鉀通道在保持神經(jīng)元的膜電位和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中發(fā)揮重要作用［2］。延遲整流鉀電流（delayed rectifier K+current，IK）作為電壓依賴性鉀電流的重要組成部分，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是海馬部位。本研究擬通過“無鎂細胞外液”誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元異常放電模型研究延遲整流鉀電流的變化，進一步探討無鎂誘導(dǎo)神經(jīng)元異常放電的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：新生24 h內(nèi)Wistar大鼠，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、NeurobasalTM-A-Medium、馬血清、B27（Gibco）、胎牛血清、D-Hanks液（Hyclone）、胰蛋白酶（Sigma）、FITC 標記羊抗兔 IgG （中杉）、倒置顯微鏡（Olympus）、Axopatch200B放大器（Axon Instrument）數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Axon Instrument）。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)：取新生24 h內(nèi)Wistar大鼠腦，顯微鏡下分離雙側(cè)海馬置于D-Hanks液；0.125%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱消化15～30 min。種植液（DMEM/F12+15%血清）終止消化，調(diào)整細胞密度為2×105/cm2后種植于2.0 cm×2.0 cm的蓋玻片上。3～4 d半量換飼養(yǎng)液（2%B27+NeurobasalTM-AMedium），體外培養(yǎng)1個月。

1.2.2 無鎂細胞外液誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元放電：無鎂液（mmol·L-1）：NaCl 145，KCl 2.5，CaCl22，HEPES 10，Glucose 10，Glycine 0.001，用 NaOH 調(diào)pH 至 7.4。細胞外液（mmol·L-1）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，用NaOH 調(diào) pH 至 7.4。電極內(nèi)液 （mmol·L-1）：K-Aspartate 50，KCl 20，HEPES 20，EGTA 1，MgCl21，Ca－Cl20.2，NaCl 13.6，K2ATP33，KOH 調(diào) pH 至 7.4。將培養(yǎng)12 d后的神經(jīng)元放入“無鎂”細胞外液處理3h后，重新放入含鎂的正常細胞外液中培養(yǎng)。電阻為2～5 MΩ。利用膜片鉗電流鉗技術(shù)在I-Normal模式下，分別記錄神經(jīng)元在正常細胞外液、“無鎂”細胞外液3 h并恢復(fù)正常細胞外液的自發(fā)性發(fā)電活動。

1.2.3 膜片鉗技術(shù)記錄延遲整流鉀電流：培養(yǎng)細胞第12 d后，應(yīng)用膜片鉗電壓鉗技術(shù)分別記錄神經(jīng)元在正常細胞外液、“無鎂”細胞外液3 h并恢復(fù)正常細胞外液的鉀電流。鉀電流的記錄方法：在V-clamp模式下，設(shè)定保持電位為-80 mV，以10 mV為步階使膜電位由-60 mV逐步去極化至+60 mV，持續(xù)時間300 ms，可記錄到外向電壓依賴性鉀電流。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，結(jié)果以x±s表示，兩組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

神經(jīng)元12~24 h后大部分貼壁，隨時間延長形態(tài)多變，突起逐漸增多，培養(yǎng)第8天后，神經(jīng)元可見錐體形狀，有軸突與樹突，細胞富有立體感，細胞核呈空泡狀，核仁清晰可見。第10天后，細胞之間通過突觸聯(lián)系，可形成典型的神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1），至28 d培養(yǎng)液中有懸浮的細胞碎片。

2.2 海馬自發(fā)性放電記錄

用正常細胞外液處理，可以記錄到神經(jīng)元（n=6）正常的自發(fā)性動作電位（圖2A）。經(jīng)無鎂細胞外液處理3 h并恢復(fù)正常細胞外液后，神經(jīng)元（n=6）可出現(xiàn)兩種自發(fā)性動作電位，一種是周期性的電壓幅度為50～80 mV“癲癇樣”自發(fā)性放電（圖2B），放電頻率為8～20 Hz；另一種是電壓幅度為50 mV左右的“楔形”放電（圖2C）。

圖1 大鼠海馬細胞的原代培養(yǎng) ×400Fig.1 Primary cultured rat hippocampal neurons×400

圖2 無鎂處理誘導(dǎo)培養(yǎng)海馬細胞癲癇樣放電Fig.2 Epileptiform discharge in cultured hippocampal neurons treated with Mg2+-free extracellular fluid

2.3 無鎂對延遲整流鉀電流的峰值與電流-電壓曲線的影響

延遲整流鉀電流為最后100 ms激發(fā)出的外向鉀電流的主要成分。用pClamp10.0計算出每個細胞的電容，電流值與電容之比為電流密度（pA·pF-1）。無鎂組（圖3B）可使對照組（圖3A）的IK峰密度值從（3.65±1.29）pA·pF－1增大到（9.09±2.41）pA·pF－1（與對照組比較，P<0.01，n=6）。以各命令電壓下的平均電流密度值（pA·pF－1）對相應(yīng)的膜電位（mV）作圖，制得I-V曲線。結(jié)果顯示，無鎂組可增大不同膜電位下的IK平均電流密度，但曲線的形狀無明顯變化（圖4）。

3 討論

圖3 無鎂處理對延遲整流鉀電流的作用Fig.3 Effect of Mg2+-free extracellular fluid on IK

圖4 無鎂處理對延遲整流鉀電流電流-電壓曲線的影響Fig.4 Effect of Mg2+-free extracellular fluid on I-V curve of IK

研究表明，無鎂誘發(fā)的神經(jīng)元自發(fā)的動作電位與癲癇發(fā)作時電生理活動相似，可以產(chǎn)生反復(fù)循環(huán)的自發(fā)性“癲癇樣”發(fā)電，而抗癲癇藥物如苯巴比妥、苯妥英鈉等都可以阻滯這類動作電位［3，4］。本研究參照Sombati等的實驗方法，利用無鎂細胞外液模擬“癲癇微環(huán)境”，發(fā)現(xiàn)經(jīng)無鎂細胞外液作用3 h后，神經(jīng)元可周期性地出現(xiàn)電壓幅度為50～80 mV“癲癇樣”自發(fā)性放電和“楔形”放電，從而證實我們建立了癲癇神經(jīng)元模型。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)神經(jīng)元必須形成突觸聯(lián)系與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有傳遞信息的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)后，才能建立癲癇自發(fā)性發(fā)電的模型，而分散培養(yǎng)的海馬細胞沒有自發(fā)性動作電位。

因此，制備表面光滑、輪廓清楚、立體感強的神經(jīng)細胞是進行膜片鉗記錄的必要前提。本方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具備適用膜片鉗研究的前提條件，特別是需要與少量的膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間具有一定程度的信息傳遞。此種培養(yǎng)條件下的的神經(jīng)元活性較強，封接率可達50%以上，為進一步的功能實驗奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

目前癲癇發(fā)病機制仍不清楚。鉀通道決定細胞膜的靜息電位、膜興奮性和動作電位的形狀與頻率，在癲癇研究中近年來愈加受到重視。研究表明鉀通道 KCNQ2/Q3、KATP、、KV1.1 在癲癇發(fā)病機制中起重要作用［5］。IK是一種重要的鉀電流成分，最初發(fā)現(xiàn)于烏賊巨軸突。哺乳動物腦中的IK電流由多種電壓依賴性鉀通道亞型構(gòu)成，包括KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV2.1、KV2.2、KV3.1 和 KV3.2［6］。

以往眾多研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的神經(jīng)元活動增加、體內(nèi)缺氧、谷氨酸刺激和實驗性缺血能導(dǎo)致IK增加［7］。Huang等［8］發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥左乙拉西坦在NG108-15細胞株中可以濃度依賴性的形式抑制IK并且使IK的穩(wěn)態(tài)激活曲線向去極化方向移動，可能是其在體內(nèi)具有抗癲癇作用的藥理機制之一。本研究顯示與對照組相比，無鎂組IK電流密度值增大，推測IK增大可能與無鎂誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)異常放電的基礎(chǔ)病理機制相關(guān)，具體的相關(guān)機制則需進一步的實驗加以證明。

［1］Engel JJr.Mesial temporal lobeepilepsy：what havewelearned?［J］.Neuroscientist，2001，7（4）：340－352.

［2］Padilla K，Wickenden AD，Gerlach AC，et al.The KCNQ2/3 selective channel opener ICA-27243 binds to a novel voltage-sensor domain site［J］.Neuronsci Lett，2009，465（2）：138－142.

［3］Blair RE，Sombati S，Churn SB，et al.Epileptogenesis causes an N-methyl-d-aspartatereceptor/Ca2+-dependent decreasein Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II activity in a hippocampal neuronal culture model of spontaneous recurrent epileptiform discharges［J］.Eur JPharmacol，2008，588（1）：64－71.

［4］Blair RE，Deshpande LS，Sombati S，et al.Prolonged exposure to WIN55，212-2 causes downregulation of the CB1 receptor and the development of tolerance to its anticonvulsant effects in the hippocampal neuronal culture model of acquired epilepsy ［J］.Neuropharmacology，2009，57（3）：208－218.

［5］Hahn A，Neubauer BA.Sodium and potassium channel dysfunctions in rare and common idiopathic epilepsy syndromes ［J］.Brain Dev，2009，31（7）：515－520.

［6］Chen X，Johnston D.Properties of single voltage-dependent K+channelsin dendritesof CA1 pyramidal neuronsof rat hippocampus［J］.J Physiol，2004，559（Pt 1）：187－203.

［7］Misonou H，Mohapatra DP，Menegola M，etal.Calcium-and metabolic state-dependent modulation of the voltage-dependent Kv2.1 channel regulates neuronal excitability in response to ischemia ［J］.JNeurosci，2005，25（48）：11184－11193.

［8］Huang CW，Tsai JJ，Huang CC，et al.Experimental and simulation studies on the mechanisms of levetiracetam-mediated inhibition of delayed-rectifier potassium current （Kv3.1）：contribution tothe firingof action potentials［J］.JPhysiol Pharmacol，2009，60（4）：37－47.