孫魯寧，孫嬌，張寧，張靜萍，張海鵬

（1.中國醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院手術(shù)室，沈陽 110004）

線粒體是真核生物細(xì)胞的一種重要細(xì)胞器，內(nèi)有上千種代謝必需的酶和蛋白，參與了包括有氧氧化、糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)等約189個(gè)生化代謝反應(yīng)。90%以上吸入體內(nèi)的氧氣被線粒體消耗掉，通過氧化磷酸化進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換，為細(xì)胞活動(dòng)提供約90%的ATP能量。線粒體除了能量轉(zhuǎn)換功能之外，還有其他多種關(guān)鍵的生理功能，它是生物體內(nèi)90%以上活性氧（reactive oxygen species，ROS）的發(fā)源地。ROS既是氧化應(yīng)激的始發(fā)性因素，又是細(xì)胞氧化還原勢能和氧化還原信號的原發(fā)調(diào)控因子，參與個(gè)體生長、發(fā)育、衰老和死亡等過程的調(diào)控。線粒體內(nèi)有多種抗氧化系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)ROS的生成和清除，從而維持正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ROS的安全低濃度穩(wěn)態(tài)；這種穩(wěn)態(tài)被打破可能會(huì)引起線粒體本身乃至整個(gè)細(xì)胞的氧化損傷，成為產(chǎn)生疾病和引發(fā)衰老的重要因素。因此，我們設(shè)想，當(dāng)外環(huán)境中氧分壓發(fā)生改變時(shí)，可能會(huì)引起上述穩(wěn)態(tài)的破壞，造成相關(guān)線粒體蛋白的表達(dá)異常，進(jìn)而影響到線粒體的生理功能，導(dǎo)致或促進(jìn)代謝類疾病的發(fā)生。為此，我們通過從整體上比較低氧組、高氧組和對照組小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白表達(dá)譜的差異，以期尋找線粒體內(nèi)調(diào)節(jié)能量和物質(zhì)代謝的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，為臨床預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供病理生理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)和繁殖。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)：直接消化法分離C57BL/6小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)。分別于37℃在低氧（5%CO2，4.5 mg/L O2）、高氧（5%CO2，14.5 mg/L O2）及常氧（5%CO2，8.5 mg/L O2）條件下培養(yǎng) 8 h。

1.2.2 線粒體蛋白提取：使用線粒體蛋白提取試劑盒（凱基生物），依照產(chǎn)品說明書的方法提取肝細(xì)胞線粒體蛋白。取上述培養(yǎng)細(xì)胞各5×107個(gè)，加入Lysis Buffer 1，研磨后 4 ℃，800 g，離心 5 min；取上清加入離心管中，使上清液與Medium Buffer的體積之比為 1∶1，4 ℃，15 000 g，離心 10 min，棄上清，在沉淀中加入Wash Buffer，重懸線粒體沉淀，再次離心10 min，棄上清；加入200μl預(yù)先配制的Lysis Buffer 2；振蕩后離心15 min，取上清，超濾濃縮，得到線粒體蛋白。使用蛋白質(zhì)分析反應(yīng)試劑（Bio-Rad laboratories）進(jìn)行蛋白定量分析后，－80℃保存。

1.2.3 雙向凝膠電泳：取出－20℃保存的樣品水化緩沖液 250 μl（8 mol/LUrea，2%CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5%carrier ampholyte pH 3-10NL），室溫融化后，加入100μg樣品中充分混勻，沿聚焦盤邊緣由左至右線性連貫地加入樣品溶液，去除IPG膠條（GE healthcare）上的塑料保護(hù)層，膠面朝下置于聚焦盤中的樣品溶液上，IPG膠條為13 cm（pH3-10NL）的非線性膠條，在每根膠條上覆蓋2 ml IPG覆蓋油，然后將聚焦盤放入電泳儀（GEcompany，Ettan IPGphor/Ⅱ），進(jìn)行等電聚焦。30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1h，8 000 V 6 h，500 V 4 h。電泳溫度 20 ℃以下，濕度38%左右。等電聚焦結(jié)束后，進(jìn)行第二向SDS-PAGE 電泳（15 mA/膠 30 min，30 mA/膠 3.5 h），電泳結(jié)束后固定過夜，銀染45 min；水洗3 min 3次；顯色5 min；終止15 min。

1.2.4 凝膠圖像獲取與軟件分析：銀染顯色的凝膠通過GS-710光密度掃描儀（Bio-Rad laboratories）獲取圖像，Imagemaster 5.0（GEhealthcare）進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，根據(jù)3次重復(fù)試驗(yàn)雙向電泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）圖譜，得到合乎統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)。

1.2.5 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解：將上述蛋白質(zhì)差異點(diǎn)用2-DE全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng) Ettan Spotter Picker（Amersham Pharmacia）切膠，置于96孔板中脫色、脫水、干燥，冷凍抽干。膠粒中加入胰蛋白酶，4℃靜置30 min使膠粒完全泡脹。然后置于37℃控溫箱內(nèi)保溫20 h。酶解后的膠粒用0.1%TFA和50%乙腈提取肽段，抽干濃縮。

1.2.6 質(zhì)譜分析與蛋白數(shù)據(jù)庫檢索：正離子模式下在Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT Mass Spectrometer質(zhì)譜儀上反射檢測（飛行管長2.7 m，加速電壓20 kV，反射電壓23 kV）獲取數(shù)據(jù)。質(zhì)譜峰的質(zhì)量準(zhǔn)確度以胰酶的自切峰為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mascot軟件在NCBInr 20071130（5678482 sequences；1961803296 residues）數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行檢索。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體蛋白差異表達(dá)

對照組、低氧組和高氧組小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白雙向凝膠電泳銀染后檢測到的蛋白點(diǎn)見圖1。用Image Master軟件對低氧、高氧和常氧組小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白圖譜進(jìn)行分析比較，共檢測了800余種線粒體蛋白，其中19種有差異表達(dá)。低氧組小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白圖譜中有16個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量與常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；高氧組小鼠有12個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量與常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其中低氧組和高氧組均與常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白點(diǎn)有9個(gè)（P<0.05）。

圖1 對照組、低氧組和高氧組小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白雙向電泳結(jié)果（銀染）Fig.1 T wo dimensional electrophoresis of mitochondrial proteins in mouse hepatocytes in normoxic，hypoxic，and hyperoxic groups（silver staining）

2.2 差異蛋白鑒定

在凝膠上切取上述差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALTI-TOF-MS）檢測，對獲取的數(shù)據(jù)采用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索。共鑒定了13種線粒體蛋白，其中低氧時(shí)表達(dá)下調(diào)的蛋白有8個(gè)，表達(dá)上調(diào)的蛋白有4個(gè)（表1）；高氧時(shí)表達(dá)下調(diào)的蛋白有3個(gè)，表達(dá)上調(diào)的蛋白有4個(gè)（表2）。已鑒定的蛋白中，胍基丁胺脲水解酶、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2、酰基輔酶A脫氫酶和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶低氧時(shí)表達(dá)下調(diào)，而高氧時(shí)表達(dá)變化不明顯；ATP合酶d鏈（ATPsynthase d chain，ATP5H）高氧時(shí)表達(dá)上調(diào)，低氧時(shí)表達(dá)變化不明顯；氨基甲酰磷酸合成酶1、谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase 1，GSHPx1）和GrpE類蛋白1在低氧和高氧時(shí)表達(dá)均下調(diào)；超氧化物歧化酶 2（superoxide dismutase 2，SOD-2）和線粒體復(fù)合體Ⅲ亞單位1在低氧和高氧時(shí)表達(dá)均上調(diào)；與殘基X相連的二磷酸核苷8（nucleoside diphosphate linked moiety X 8，nudix-8） 在低氧時(shí)表達(dá)下調(diào)而高氧時(shí)表達(dá)上調(diào)。

表1 低氧組和對照組小鼠肝細(xì)胞差異表達(dá)的線粒體蛋白T ab.1 D ifferentially expressed mitochondrial proteins in mouse hepatocytes in hypoxic and normoxic groups

表2 高氧組和對照組小鼠肝細(xì)胞差異表達(dá)的線粒體蛋白T ab.2 D ifferentially expressed mitochondrialproteins in mouse hepatocytes in hyperoxic and normoxic groups

3 討論

線粒體是細(xì)胞有氧氧化的主要細(xì)胞器，良好的氧氣供應(yīng)和正常的用氧能力是維持其代謝功能的前提。機(jī)體氧不足或氧過量均可影響線粒體蛋白的表達(dá)及其正常功能，進(jìn)而引起各種病理生理學(xué)改變，這可能正是目前在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)、年輕化趨勢的代謝類疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。為此，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從整體上比較低氧和高氧條件下培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞線粒體蛋白的表達(dá)變化，并探討其相關(guān)機(jī)制，國內(nèi)外均未見類似報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)：參與呼吸作用的線粒體蛋白ATP5H和線粒體復(fù)合體Ⅲ亞單位1在高氧時(shí)表達(dá)上調(diào)，低氧時(shí)前者變化不明顯，后者表達(dá)上調(diào)。參與自由基清除的GSHPx1和SOD-2變化方向恰好相反，前者在高氧和低氧時(shí)表達(dá)均下調(diào)而后者均上調(diào)。參與DNA損傷修復(fù)的nudix-8在高氧時(shí)表達(dá)上調(diào)。與代謝有關(guān)的氨基甲酰磷酸合成酶1、胍基丁胺脲水解酶、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2、酰基輔酶A脫氫酶和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶在高氧和低氧時(shí)表達(dá)均下調(diào)。

線粒體呼吸鏈的功能是進(jìn)行生物氧化，并與ATP合酶（磷酸化過程）相耦聯(lián)，共同完成氧化磷酸化過程，在線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程中，電子的化學(xué)勢能被復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ所利用，同時(shí)將基質(zhì)中的質(zhì)子泵到膜間隙中，從而將能量儲存在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)梯度中，最后質(zhì)子通過ATP酶回到基質(zhì)中，其電化學(xué)勢能被用來合成ATP分子。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體復(fù)合體Ⅲ和ATP5H在高氧時(shí)表達(dá)增高，但他們的具體作用尚不明確。由于線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅱ所還原的醌均被線粒體復(fù)合體Ⅲ所氧化，其電子被用來還原處在線粒體膜間隙內(nèi)的細(xì)胞色素C，因而有人認(rèn)為高氧時(shí)線粒體復(fù)合體Ⅲ的表達(dá)增多可能是造成細(xì)胞氧化損傷的基本病理機(jī)制［1］。至于ATH5H在高氧時(shí)表達(dá)增高有何意義還不十分清楚。如前所述，線粒體為細(xì)胞活動(dòng)提供約90%的ATP能量。在ATP合成過程中，F(xiàn)1F0型ATP合成酶在細(xì)胞能量交換中是一個(gè)關(guān)鍵酶。這個(gè)大分子蛋白復(fù)合體利用電子梯度和相關(guān)的膜電勢來合成ATP，ATH5H編碼蛋白為ATP合成酶跨膜結(jié)構(gòu)－F0復(fù)合體的重要組成部分。Yusenko等［2］發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞瘤中ATP5H的表達(dá)增高，其具體作用還有待于進(jìn)一步研究。

GSH-Px1和SOD-2是線粒體內(nèi)的2種主要抗氧化酶，SOD可使超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成水和H2O2，后者又被GSH-Px等清除。二者協(xié)同作用，清除在細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物，從而減輕細(xì)胞的過氧化損傷，起著平衡細(xì)胞內(nèi)ROS總量的作用。當(dāng)細(xì)胞暴露于低氧或高氧的環(huán)境中時(shí)，ROS的產(chǎn)生增多，為了維持正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ROS的安全低濃度穩(wěn)態(tài)，GSH-Px1和SOD-2的表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，GSH-Px1在低氧和高氧時(shí)表達(dá)均下調(diào)而SOD-2表達(dá)均上調(diào)，因而我們推測后者在線粒體抗氧化機(jī)制中可能起到了更為重要的作用。作為細(xì)胞內(nèi)氧自由基的清除劑，SOD-2具有抗衰老、提高細(xì)胞對氧應(yīng)激反應(yīng)的耐受性及抑制腫瘤發(fā)生等方面的作用。Ilizarov等［3］的研究表明，SOD-2可明顯提高肺上皮細(xì)胞在高氧（95%O2）環(huán)境中的生存率，且這種作用明顯強(qiáng)于過氧化氫酶。不僅如此，SOD-2還可以明顯減輕腦缺血引起的神經(jīng)元損傷［4］。SOD-2是一種誘導(dǎo)酶，在缺血缺氧、放射性損傷及氧化應(yīng)激等情況下產(chǎn)生增多，起到細(xì)胞保護(hù)作用，但是其涉及到的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一直不甚明確，因而也是研究的熱點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）均被認(rèn)為與SOD-2的表達(dá)有關(guān)［5~7］，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。GSH-px也是線粒體抗氧化屏障的組分之一，它與多種疾病發(fā)病的關(guān)系得到了廣泛的研究，但是因?yàn)樗谋磉_(dá)易受到多種因素的影響，使其作用受到限制。有報(bào)道提示，高壓氧暴露出現(xiàn)氧中毒，氧自由基產(chǎn)生增多時(shí)，GSH-px活力易受抑制，可能是抗氧化酶防御系統(tǒng)中的薄弱環(huán)節(jié)［7］。

在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)，nudix-8在高氧時(shí)表達(dá)上調(diào)。Nudix超家族包含分布廣泛的酶家族，這些酶在細(xì)胞中具有清除有毒的核苷酸代謝物及調(diào)節(jié)核苷酸水平和代謝的重要作用，被認(rèn)為與腫瘤和衰老有關(guān)［8，9］。高氧時(shí)，線粒體內(nèi) ROS 產(chǎn)生增多，氧自由基可攻擊許多重要生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)。DNA受到攻擊后，產(chǎn)生20多種修飾堿基，其中8-羥基-脫氧鳥苷（8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine，8-oxodG）是一種有強(qiáng)致突變作用的DNA氧化損傷產(chǎn)物［10］，此時(shí)nudix蛋白表達(dá)增多可清除該產(chǎn)物，從而有助于修復(fù)氧化損傷。

綜上，當(dāng)細(xì)胞暴露于低氧或高氧的環(huán)境中時(shí)，ROS產(chǎn)生增多，其中高氧時(shí)線粒體復(fù)合體Ⅲ表達(dá)增多可能是造成細(xì)胞氧化損傷的基本病理基礎(chǔ)，而各種參與代謝的酶表達(dá)減少進(jìn)一步影響了線粒體的代謝功能，使細(xì)胞損傷加重。與此同時(shí)，SOD-2表達(dá)增多，以清除過多的ROS，從而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。在這個(gè)過程當(dāng)中，參與損傷基因修復(fù)的nudix蛋白表達(dá)增多可以減輕細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷。上述這些因素相互作用，共同影響線粒體的能量和物質(zhì)代謝過程，從而引起相應(yīng)的病理生理學(xué)改變，但其中涉及的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究證明。

此外，在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)了兩種未知蛋白在低氧時(shí)表達(dá)上調(diào)，它們是否是影響線粒體代謝功能的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，目前尚無法確定。自Gerlt等［11］首次利用計(jì)算機(jī)程序，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列成功地精確預(yù)測了蛋白功能以來，有關(guān)未知蛋白功能預(yù)測的研究工作不斷取得進(jìn)展。然而，蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子只有處于其特定的三維空間結(jié)構(gòu)時(shí)，才能獲得特定的生物學(xué)活性；三維空間結(jié)構(gòu)稍有破壞，很可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的降低甚至喪失。所以，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究是進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測及蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，如何保證蛋白離體后空間構(gòu)象不被破壞一直是這類研究的難題，我們正在進(jìn)行相關(guān)的嘗試，期望能夠初步了解這兩種未知蛋白功能。

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