王國麗，劉瑩，宿文輝，許琳，孫盧浩然，盧敏

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽 110001）

青蒿素于20世紀(jì)70年代由我國科學(xué)家從植物黃蒿中成功分離后，替代傳統(tǒng)抗瘧藥喹啉，成為世界范圍治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物。青蒿素及其衍生物具有抗寄生蟲、抗孕、抗腫瘤、抗纖維化、抗病毒、抗真菌、調(diào)節(jié)免疫和心血管系統(tǒng)等廣泛的藥理作用，其中的抗腫瘤作用近年來逐漸引起關(guān)注［1，2］。二氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素衍生物的主要活性代謝體，1998年美國國立癌癥研究所報(bào)告了在抗腫瘤藥物篩查項(xiàng)目中DHA對60種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的檢測結(jié)果［3］。DHA的抗腫瘤作用，在不同的結(jié)腸癌細(xì)胞株得到驗(yàn)證，并且發(fā)現(xiàn)可能通過線粒體途徑或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3~6］。

本研究利用微陣列RTProfilerTMPCRArray Human Apoptosis和實(shí)時定量PCR方法，檢測DHA處理前后結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的84種凋亡通路關(guān)鍵蛋白的基因表達(dá)水平，以期全面認(rèn)識并深入闡明DHA對結(jié)腸癌細(xì)胞的促凋亡分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DHA購自中國藥品生物制品檢定所；細(xì)胞培養(yǎng)、RNA提純及反轉(zhuǎn)錄試劑主要購自寶生物和Invitrogen 公司；RTProfilerTMPCR Array Human Apoptosis（PAHS-012A）購自 SABiosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素。培養(yǎng)箱37℃、5%CO2、100%濕度。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：DHA對HCT116細(xì)胞的生長抑制率通過MTT實(shí)驗(yàn)測定。接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)5 000/孔。培養(yǎng)至24 h，更換加入不同濃度DHA的培養(yǎng)液。DHA濃度分別為0（對照組）、40、80、160μmol/L，每濃度設(shè)6個平行孔。加藥后24 h、48 h或72 h進(jìn)行呈色反應(yīng)。每孔加入MTT溶液（5 g/L）20μl繼續(xù)孵育 4 h，加入 150μl DMSO，振蕩 10 min后在492 nm處測定吸光度（Absorbance，A）。各濃度平行孔吸光度均值減去無細(xì)胞孔吸光度均值后，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

抑制率=［A（對照組）-A（用藥組）］/A（對照組）×100%1.2.3 凋亡基因表達(dá)圖譜檢測：接種等量HCT116細(xì)胞于直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞融合度約40%，更換培養(yǎng)基。DHA組細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)DHA濃度80μmol/L，對照組細(xì)胞培養(yǎng)基未加入DHA。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用Trizol（Invitrogen）提純RNA。然后用DNase I消化RNA樣品，去除可能存在的基因組DNA，并用RNeasy誖MinE－luteTM純化試劑盒（Qiagen）對獲得的RNA進(jìn)行純化，再通過瓊脂糖電泳和紫外吸收測定法檢測RNA的質(zhì)量、濃度和純度。cDNA合成應(yīng)用SuperScript.IIIReverse Transcriptase（Invitrogen），20 μl反應(yīng)體系中加入總RNA 1.5μg。操作按照說明書進(jìn)行。

cDNA 與 2倍 SuperArray PCR master mix（Cat.No.PA-112）充分混合，加10μl至PCR Array對應(yīng)的每個孔中。實(shí)時定量PCR程序設(shè)置為變性95℃，10 min；擴(kuò)增 40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min。采集熒光，進(jìn)行溶解曲線分析。

數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCt方法。熒光閾值設(shè)定為0.15，取各 PCR Array管家基因 B2M、HPRT1、GAPDH 和 ACTB 的閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）均值為本底，按公式（1）計(jì)算ΔCt。ΔΔCt的計(jì)算公式為（2）。通過 2－ΔΔCt計(jì)算 DHA 組與對照組對應(yīng)基因的表達(dá)差異［7］。

上調(diào)倍數(shù)（fold up-regulation）＞2為基因表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)倍數(shù)（fold down-regulation）＜-2為基因表達(dá)顯著下調(diào)?；虮磉_(dá)上調(diào)及下調(diào)的定性結(jié)論具有可重復(fù)性。實(shí)時PCR微陣列實(shí)驗(yàn)由康成生物工程有限公司（中國上海）提供技術(shù)服務(wù)。

2 結(jié)果

2.1 DHA處理的條件選擇及RNA樣品的鑒定

DHA作用于HCT116細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HCT116細(xì)胞的生長抑制率隨DHA濃度的增加及作用時間延長而升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［5，6］，見表1。我們選擇80μmol/L 24 h做為DHA組細(xì)胞的藥物處理?xiàng)l件，該條件處理后的細(xì)胞生長抑制率約9%，絕大多數(shù)細(xì)胞處于凋亡前期，其基因表達(dá)改變可反映DHA誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制。

表1 D H A對結(jié)腸癌細(xì)胞HC T116的生長抑制T ab.1 Inhibitory effect of D H A on cellgrowth in HC T116 cells

DHA組和對照組RNA樣品的Abs260/Abs280比值分別為2.00和2.02。變性瓊脂糖凝膠電泳照片上，DHA組和對照組的28S和18S核糖體RNA帶均亮而濃，前者密度大約是后者的2倍，而且能觀察到一個由低分子量RNA組成的略擴(kuò)散帶（圖1）。Abs260/Abs280比值分析和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實(shí)RNA樣品的純度和質(zhì)量符合微陣列研究的要求。

圖1 RNA樣品的變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig.1 D enaturing agarose gel electrophoresis of RNA

2.2 DHA誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞凋亡基因差異表達(dá)

與對照組相比較，DHA組HCT116細(xì)胞被檢測的84種凋亡基因中，有35種基因表達(dá)水平顯著改變，即上調(diào)倍數(shù)高于2或者下調(diào)倍數(shù)低于－2。TNFα、TNFα、TRAILR、CASP、GADD45GADD45A 等 26 種基因表達(dá)顯著上調(diào)，而TP73、CASP2、Bcl2等9種基因顯著下調(diào)，見表2。

3 討論

本研究通過DHA誘導(dǎo)的凋亡基因表達(dá)圖譜結(jié)果表明：促凋亡基因中，TNFα、TNFR1、TRAILR、CASP10、CASP3、CASP4、GADD45 等基因表達(dá)顯著上調(diào)，CAPS6、P73、BIK等表達(dá)下調(diào)；抗凋亡基因中，BCL2、AKT、BAG1的表達(dá)下調(diào)，而一些IAP家族成員的基因表達(dá)上調(diào)2～4倍。

表2 D H A誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HC T116凋亡基因的顯著差異表達(dá)T ab.2 Significantly differential expressions of apoptotic genes induced by D H A in HC T116 cells

結(jié)合本研究檢測到的凋亡基因顯著差異表達(dá)及他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［3～6，8～9］，我們提出了 DHA 誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡的信號網(wǎng)絡(luò)假說（圖2）。DHA作用后HCT細(xì)胞內(nèi)部分促凋亡基因表達(dá)的顯著上調(diào)和部分抗凋亡基因的顯著下調(diào)提示DHA可能不同程度地依賴3條經(jīng)典凋亡途徑誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的凋亡，其一為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑；其二為TNFR1、TRAILR等死亡受體介導(dǎo)途徑；其三為線粒體途徑。Uhlemann等提出青蒿素可通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵（SERCA），升高胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)揮藥理作用，而且結(jié)合部位與SERCA1a的特異性抑制劑毒胡蘿卜素相同［8］。Lu等［4］則認(rèn)為DHA可能通過鐵依賴的自由基產(chǎn)生促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的高表達(dá)。因此胞質(zhì)Ca2+濃度升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可能決定其復(fù)雜凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的引發(fā)。此外，在DHA誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡的過程中，存在BID蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑的交叉點(diǎn)的可能性，胞質(zhì)Ca2+濃度升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以驅(qū)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)BID蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體誘發(fā)凋亡［9］。

圖2 D H A誘導(dǎo)HC T116細(xì)胞凋亡的信號網(wǎng)絡(luò)假說Fig.2 H ypothesis of D H A-induced apoptosis networ k in HC T116 cells

實(shí)時PCR微陣列技術(shù)結(jié)合實(shí)時定量PCR和其他DNA微陣列基因芯片的優(yōu)點(diǎn)，在一次實(shí)驗(yàn)中能夠準(zhǔn)確定量檢測上百個基因的mRNA水平。既克服了實(shí)時定量PCR檢測基因表達(dá)圖譜工作量大耗時久的缺點(diǎn)，又將檢測精確度提高到與實(shí)時定量PCR相當(dāng)?shù)乃?，?shí)驗(yàn)結(jié)果無須再進(jìn)行實(shí)時定量PCR驗(yàn)證。本研究應(yīng)用人凋亡實(shí)時PCR微陣列較全面地檢測了凋亡前期DHA對結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)分子的基因表達(dá)影響，增進(jìn)了對DHA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的理解。經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證和完善，可望對DHA抗腫瘤藥物作用機(jī)制的研究帶來突破性進(jìn)展。

［1］賀曉青，方鵬飛.青蒿素極其衍生物的藥理作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（6）：528－530.

［2］孫雅潔，王京燕.青蒿素及其衍生物體外抗腫瘤活性研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，25（4）：315－317.

［3］Beekman AC，Wierenga PK，Woerdenbag HJ，et al.Artemisinin-derived sesquiterpenelactones aspotential antitumor compounds：cytotoxic action against bone marrow and tumor cells［J］.Planta Med，1998，64（7）：615－619.

［4］Lu JJ，Chen SM，Zhang XW，et al.The anti-cancer activity of dihydroartemisinin is associatedwith induction of iron-dependent endoplasmic reticulum stress in colorectal carcinoma HCT116 cells［J］.Invest New Drugs，2010，July 7，Epub ahead of print.

［5］邵義如，朱尤慶，劉敏.二氫青蒿素對結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖凋亡的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（3）：319－323.

［6］朱奔奔，謝東.二氫青蒿素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116并誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.航空航天醫(yī)藥，2010，21（7）：1083－1085.

［7］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 （-delta delta C（T））method［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［8］Uhlemann AC，Cameron A，Eckstein-Ludwig U，et al.A single amino acid residue can determin the sensitivity of SERCAs to artemisinins［J］.Nat Struct Mol Biol，2005，12（7）：628－629.

［9］胡潔，何東花，高良，等.Bid蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的凋亡過程中的作用［J］.中華血液學(xué)雜志，2007，28（7）：466－469.