趙曉冬，傅 蓉，王全一，李彥博

β-內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的發(fā)生率與其高分子雜質(zhì)的含量有關(guān)，在臨床上最常見的不良反應(yīng)是速發(fā)型過敏反應(yīng)。引發(fā)β-內(nèi)酰胺類抗生素速發(fā)型過敏反應(yīng)的過敏原并不是β-內(nèi)酰胺類抗生素本身，而是其中存在的高分子聚合物［1］。因此，對(duì)高分子聚合物的分析是當(dāng)前β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)控研究的關(guān)鍵。注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉為《中國(guó)藥典》2005年版(二部)收載品種［2］，該品種為含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方抗生素。其主要活性成分氨芐西林的穩(wěn)定性較差，有關(guān)物質(zhì)中高聚物雜質(zhì)所占比重較大，易形成氨芐西林的二聚、三聚、四聚和五聚物等高分子雜質(zhì)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都顯示出強(qiáng)烈的引發(fā)過敏反應(yīng)性，但該品種項(xiàng)下卻未規(guī)定高分子聚合物的檢查項(xiàng)。采用《中國(guó)藥典》2005年版中所載的葡聚糖凝膠Sephadex G10色譜系統(tǒng)［2］測(cè)定其中的高分子聚合物時(shí)，不能將氨芐西林聚合物與舒巴坦雜質(zhì)有效分離，舒巴坦鈉的出峰位置與β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物相同，因此，無法測(cè)定該藥物中的氨芐西林聚合物。筆者通過對(duì)其復(fù)方制劑中氨芐西林二聚物這一指示性高分子聚合物的分析，建立了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏和專屬的HPLC法，以測(cè)定注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中的高分子聚合物。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜分析儀(安捷倫公司);AS5150超聲波發(fā)生器(AUTO Research.Inc);CP225D電子天平(Sartorius公司);葡聚糖凝膠G10填充柱(上海藥檢所東方公司)。

1.2 試藥與試劑 注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉(規(guī)格:1.5 g，批號(hào):20090801，?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?;氨芐西林對(duì)照品(批號(hào):130410-200706，85.7%)、舒巴坦對(duì)照品(批號(hào):130430-200906，89.7%)、頭孢拉定對(duì)照品(批號(hào):130427-200306，91.8%)、葡聚糖2000均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試藥有限公司);冰醋酸:分析純(汕頭市西隴化工廠);十二烷基硫酸鈉:化學(xué)純(遼寧省醫(yī)藥經(jīng)貿(mào)公司試劑廠);乙腈:色譜純(Concord Technology Co.Ltd)。

2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

利用Sephadex G10凝膠色譜法和HPLC法［3］對(duì)注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中高分子雜質(zhì)的分離情況進(jìn)行了比較。從圖1-A可見，采用Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)，舒巴坦雜質(zhì)峰與氨芐西林聚合物峰在由葡聚糖2000定位的Kav=0的洗脫區(qū)間內(nèi)重疊，使氨芐西林聚合物無法定量測(cè)定。但采用HPLC法，其中明確指出與主峰相對(duì)保留時(shí)間為2.8的為氨芐西林二聚物峰，見圖1-B。因此，可以通過控制氨芐西林二聚物這一指示性雜質(zhì)的含量，控制該藥物中的高分子聚合物。最后確定色譜條件:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A為12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶50∶900);流動(dòng)相 B 為12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶400∶550)，檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。先以流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(85∶15)等梯度洗脫，待氨芐西林峰洗脫完畢后，立即按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)①:取本品0.2 g，加水1.0 mL使其溶解，于60℃水浴中加熱1 h，量取0.5 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，氨芐西林主峰保留時(shí)間約2.8倍處的較大雜質(zhì)峰為氨芐西林二聚物峰;系統(tǒng)適用性試驗(yàn)②:另取舒巴坦對(duì)照品、氨芐西林對(duì)照品、頭孢拉定對(duì)照品適量，加流動(dòng)相A溶解并制成每1 mL中約含舒巴坦0.15 mg、氨芐西林0.3 mg、頭孢拉定0.02 mg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，舒巴坦、氨芐西林、頭孢拉定峰的分離度應(yīng)大于3.0。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序表

3 溶液的制備

取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A溶解定量稀釋，制成每1 mL約含氨芐西林鈉2.7 mg的溶液，作為供試品溶液;另取氨芐西林對(duì)照品適量，精密稱定，流動(dòng)相A溶解定量稀釋，制成每1 mL約含氨芐西林27 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。

4 方法與結(jié)果

4.1 供試品中氨芐西林二聚物線性關(guān)系試驗(yàn)取本品加流動(dòng)相，制成含氨芐西林13.50 mg/mL的溶液。再用流動(dòng)相A稀釋，制成含氨芐西林分別為 0.675、1.350、2.700、4.050、5.400 mg/mL 的系列溶液。各進(jìn)樣20 μL。以氨芐西林二聚物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、氨芐西林鈉進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，得線性回歸方程:Y=3.844 ×10 X-0.324 4，r=1.000 0。結(jié)果表明，氨芐西林在0.675～5.4 mg/mL范圍內(nèi)，與氨芐西林二聚物峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)(A)、HPLC法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)①(B)、HPLC法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)②(C)注:1.氨芐西林高聚物;2.氨芐西林;3.舒巴坦雜質(zhì);4.舒巴坦;5.氨芐西林二聚物;6.頭孢拉定

4.2 氨芐西林對(duì)照品線性關(guān)系試驗(yàn) 取氨芐西林對(duì)照品19.60 mg，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至25 mL，搖勻，再加流動(dòng)相 A稀釋，制成含氨芐西林6.72、13.44、26.88、40.31、53.75 μg/mL 的系列溶液，各進(jìn)樣20 μL。以氨芐西林峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、氨芐西林進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，得線性回歸方程:Y=1.116 X －0.244 9，r=1.000 0。結(jié)果表明，氨芐西林在6.719～53.75 μg/mL范圍內(nèi)與氨芐西林峰面積呈良好線性關(guān)系。

4.3 氨芐西林二聚物峰的精密度試驗(yàn) 取本品加流動(dòng)相A，制成含氨芐西林2.7 mg/mL的溶液。連續(xù)進(jìn)樣 5次，各進(jìn)樣 20 μL。結(jié)果 RSD為0.7%，說明本法精密度良好。

4.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品加流動(dòng)相，制成含氨芐西林2.7 mg/mL的溶液，分別于放置0、1、2、4 h 時(shí)，進(jìn)樣 20 μL。結(jié)果表明，在 4 h 內(nèi)，氨芐西林二聚物無明顯變化，RSD為0.5%，表明供試品溶液中氨芐西林二聚物的穩(wěn)定性良好。

4.5 供試品中氨芐西林二聚物的專屬性試驗(yàn)進(jìn)行如下破壞試驗(yàn)。①堿破壞試驗(yàn):取本品45.46 mg，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液 1 mL，放置 10 min，加0.1 mol/L HCl溶液1 mL，加流動(dòng)相 A稀釋至10 mL;②酸破壞試驗(yàn):取本品45.55 mg，加1 mol/L HCl溶液1 mL，放置1 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，加流動(dòng)相A稀釋至10 mL;③熱破壞試驗(yàn):取本品45.33 mg，置稱量瓶中，100℃烘箱中加熱1 h，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至10 mL;④氧化破壞試驗(yàn):取本品45.39 mg，加過氧化氫溶液1.5 mL放置10 min，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至10 mL;⑤光破壞試驗(yàn):取供試品45.33 mg，置稱量瓶中，攤平，254、365 nm紫外燈下照射24 h，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至10 mL。各進(jìn)樣20 μL。結(jié)果表明，此色譜系統(tǒng)在各破壞試驗(yàn)中使其降解產(chǎn)物與氨芐西林、氨芐西林二聚物、舒巴坦均得到了較好的分離，除個(gè)別峰之外，絕大部分峰間的分離度大于1.5，認(rèn)為此方法基本可行。

4.6 樣品中氨芐西林二聚物檢查 取本品適量，照“3”項(xiàng)下制成供試品溶液和對(duì)照溶液;取本品0.2 g，照“2”項(xiàng)下制成系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液①;取舒巴坦對(duì)照品、氨芐西林對(duì)照品、頭孢拉定對(duì)照品適量，照“2”項(xiàng)下制成系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液②。照“2”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣20 μL。由結(jié)果知，樣品氨芐西林二聚物含量符合規(guī)定。色譜圖見圖2。

圖2 氨芐西林二聚物檢查供試品色譜圖注:1.舒巴坦;2.氨芐西林;3.氨芐西林二聚物

5 討論

5.1 由梯度洗脫方法分析復(fù)方制劑樣品熱降解溶液的色譜圖(圖1-B)可知，制劑中的主成分和各雜質(zhì)均能得到較好的分離，且二聚物在此條件下為諸雜質(zhì)中最大的雜質(zhì)，有利于對(duì)氨芐西林二聚物峰位的確定。因此，熱降解溶液可作為系統(tǒng)適用性溶液，以考量實(shí)際應(yīng)用中方法的有效性。同時(shí)，可以與結(jié)構(gòu)相似物頭孢拉定之間的分離度作為系統(tǒng)適用性考察的另一指標(biāo)(圖1-C)。

5.2 采用主成分自身對(duì)照法時(shí)，在目前無法獲得氨芐西林二聚物對(duì)照品的情況下，參考《英國(guó)藥典》2008年版氨芐西林有關(guān)物質(zhì)中對(duì)氨芐西林二聚物的相關(guān)限度，制定為“氨芐西林二聚物峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的4.5倍(4.5%)”。

［1］ 趙曉冬，傅蓉，畢開順.分子排阻色譜法測(cè)定注射用頭孢呋辛鈉舒巴坦鈉中的高分子雜質(zhì)［J］.藥物分析雜志，2010，30(1):95-98.

［2］ 中國(guó)藥典［S］.二部.2005:786-787，(附錄)35-36.

［3］ British PharmacopoeiaCommission.British Pharmacopoeia 2008［S］.London:The Stationery Office，2008:155-158.