趙 雯，潘志明，耿士忠，康喜龍，方 強(qiáng)，叢秋霞，焦新安

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

白細(xì)胞介素(Interleukin，IL-17)是一種由效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-6、TNF-α和趨化因子等，最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[1]。2009年Yoo等首先克隆出雌性櫻桃谷北京鴨的 IL-17基因(duIL-17)，其序列與雞 IL-17(chIL-17)和哺乳動(dòng)物IL-17氨基酸同源性分別為84%和37%[2]，這表明家禽IL-17既具有一定的保守性，又各自具有種屬特異性。另外，目前尚未有duIL-17檢測(cè)試劑的研究報(bào)道。為此，本研究克隆我國(guó)地方品種麻鴨的IL-17基因，并且進(jìn)行了原核表達(dá)，在此基礎(chǔ)上探討了表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性，為duIL-17單克隆抗體的制備提供條件。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 pGEX-6P-1、DH5α和BL21均由江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、高保真TaqDNA聚合酶、pCR2.1載體、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒和RNA提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Promega公司；酵母抽提物和蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司；ConA、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司；小牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；麻鴨購(gòu)自揚(yáng)州某種鴨場(chǎng)；鼠抗雞IL-17多克隆抗體(ELISA效價(jià)1∶12800)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的17 mRNA序列(EU366165.1)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)用于PCR擴(kuò)增IL-17基因的的引物。上游引物：5'-TAGG ATCCATGTCTCCAACCCTTCGTGCTT-3'；下游引物：5'-TAGTCGACTTGCTCTTGCACCACAGGCTCC-3'。下劃線分別為BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位點(diǎn)序列。預(yù)期擴(kuò)增出的目的條帶大小為534 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 脾臟淋巴細(xì)胞的分離 取麻鴨脾臟，將其制成單細(xì)胞懸液，分離其中淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞加至24孔培養(yǎng)板中，1×107個(gè)/孔，每孔再加入5 μL ConA(500 mg/L)，于5%CO241℃培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，按試劑盒步驟提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 5 μL、5×buffer 2 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo(dT)Primer 0.5 μL、Random 6 Primer 0.5 μL、RNase Free H2O 1.5 μL，總體積 10 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 s。cDNA用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.5 duIL-17基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PCR擴(kuò)增約534 bp的IL-17基因片段。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物與pCR2.1載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCR2.1-duIL17，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，提取質(zhì)粒后用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，鑒定正確的重組質(zhì)粒由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。抽提pCR2.1-duIL17，經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后回收目的片段，與pGEX-6P-1載體相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-duIL17。

1.6 duIL-17的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將pGEX-duIL17轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，經(jīng)抗性篩選后，挑取單個(gè)克隆擴(kuò)增后進(jìn)行PCR鑒定。以0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。裂解誘導(dǎo)產(chǎn)物，離心分別取上清和沉淀。將誘導(dǎo)產(chǎn)物、誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE 分析[3]。

1.7 Western blot分析 將誘導(dǎo)的重組菌和非重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用含100 mL/L小牛血清的PBST 4℃作用；以鼠抗雞IL-17抗體作為一抗(1∶2000稀釋)，作用2 h；充分洗滌后以羊抗鼠HRP-IgG作為二抗(1∶1000稀釋)作用1 h，PBST洗滌5次后，DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約500 bp大小的目的片段，而且無(wú)非特異性條帶(圖1)。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的序列(EU366165.1)相比對(duì)，結(jié)果顯示第174位堿基由C突變?yōu)門(mén)，并且為沉默突變。將PCR產(chǎn)物及pGEX-6P-1載體用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，回收后連接，獲得重組質(zhì)粒pGEX-duIL17。重組質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后電泳，出現(xiàn)約500 bp的插入片段和4900 bp的載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明IL-17基因已被正確插入到表達(dá)載體pGEX-6P-1中。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-duIL17轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，以質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增duIL-17基因片段，出現(xiàn)約500 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，證明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-duIL17已成功導(dǎo)入宿主菌BL21。

挑取重組菌pGEX-duIL17/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明duIL-17基因在大腸桿菌中獲得表達(dá)，重組蛋白分子量約為45 ku(圖2)，而且重組蛋白主要以包涵體形式存在。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明，鼠抗雞IL-17抗體能夠識(shí)別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌在45 ku位置的特異性條帶，這與表達(dá)的重組蛋白GST-duIL17的大小相符(圖3)，表明重組蛋白能夠被鼠抗雞IL-17抗體識(shí)別。

本研究中克隆的麻鴨duIL-17基因，與Yoo等克隆的櫻桃谷北京鴨IL-17基因相比較，其核苷酸和氨基酸的同源性均為96.8%，顯示IL-17基因在相同種屬間的同源性很高[2]。目前尚缺少有關(guān)鴨IL-17方面的檢測(cè)試劑，本研究則為duIL-17單克隆抗體的研制提供了有用的實(shí)驗(yàn)材料。

Iwakura Y,Ishigame H.The IL-23/IL-17 axis in inflammation[J].J Clin Invest,2006,116(5):1218-1222.

Yoo J,Jang S I,Kim S,et al.Molecular characterization of duck interleukin-17[J].Vet Immunol Immunopathol,2009,132(2-4):318-322.

薩姆布魯克J，拉塞爾 D W等著，黃培堂，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 [M].第3版.北京科學(xué)出版社，2002，1474-1480.