何 昕，張博愛，賈延劼，王繼先

鹽酸法舒地爾 (fasudil hydrochloride，F(xiàn)SD)是一種新型、多靶點的Rho激酶抑制劑和細胞內(nèi)Ca2+拮抗劑，對急性缺血性腦損害具有顯著的神經(jīng)保護和治療作用［1－2］，其在腦血管疾病中的臨床作用逐漸受到重視。關(guān)于FSD對脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)引起的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷是否有抑制作用以及這種作用是否與抑制磷酸化 c－Jun氨基端激酶1(JNK1)有關(guān)鮮有報道。本實驗通過LPS誘導(dǎo)神經(jīng)元建立損傷模型，用FSD干預(yù)后檢測神經(jīng)元凋亡率及JNK1在細胞內(nèi)表達變化，探討FSD對興奮毒性致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供SPF級健康新生SD大鼠。FSD(天津紅日藥業(yè)股份有限公司);LPS、Neurobasal培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二抗 (羊抗兔)、JNK1和磷酸化的JNK1(美國Sigma公司);胎牛血清、B27試劑 (美國Gibco公司);吖啶橙 (acridine orange，AO)/嗅乙啶 (ethidium bromide，EB)熒光試劑盒、乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH)定量檢測試劑盒 (武漢博士德生物制品公司);0.3%Triton X－100(北京中山試劑公司);其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng) 新生 (出生24 h以內(nèi))SD大鼠經(jīng)乙醇消毒后斷頭，取出大腦皮質(zhì)腦組織，用冰冷D－Hank's液洗3次，仔細輕柔地剝離血管及腦膜，用眼科剪剪成約1 mm3的組織塊，放于0.25%的胰蛋白酶中消化約10 min，期間每隔5 min晃動1次。加入胎牛血清終止消化，移入無菌離心管并用吸管吹打均勻;置離心機中以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入培養(yǎng)液 (Neurobal培養(yǎng)基500 ml添加B27試劑10 ml;青霉素G 5萬U;鏈霉素5萬U;L－谷氨酰胺1 mmol，pH值7.20)吹打至細胞分散均勻，用200目篩網(wǎng)過濾到培養(yǎng)皿中，使細胞密度為 (1～3) ×106個/cm3，然后接種到用0.01%多聚左旋賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板中。置于含5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，24 h后第1次換液，以后每3 d換液1次，培養(yǎng)7 d后備用。

1.3 實驗分組 細胞隨機分為3組:(1)對照組;(2)LPS組:培養(yǎng)基中加入LPS使其終濃度為10 mg/L;③FSD+LPS組:培養(yǎng)基中加入FSD使其終濃度分別為50μmol/L、100 μmol/L和200μmol/L，預(yù)處理細胞1 h，再加入LPS(10 mg/L)。對照組神經(jīng)元仍置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);LPS組和FSD+LPS組均接受LPS(10 mg/L)處理24 h。3組實驗平行進行，每組實驗均重復(fù)3次。

1.4 神經(jīng)元鑒定 用神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament protein 200，NF200)免疫組織化學(xué)方法對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進行鑒定，結(jié)果表明神經(jīng)元純度在90%以上。

1.5 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下，正常細胞形態(tài)一致，細胞體光滑，細胞突起交叉成網(wǎng)，折光性強。受損細胞大小、形態(tài)出現(xiàn)不同程度改變，突起縮短、分支減少，軸突出現(xiàn)串珠樣改變，折光性下降。

1.6 LDH活性測定 把處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)基上清液放于EP管中，按LDH試劑盒說明書進行操作，測定LDH。

1.7 神經(jīng)元凋亡檢測

1.7.1 AO/EB染色應(yīng)用 采用AO/EB熒光試劑盒行AO/EB染色，操作步驟按照試劑盒說明書進行。熒光顯微鏡下可見4種細胞形態(tài):早期凋亡細胞 (VA)，核染色質(zhì)著綠色、核呈現(xiàn)固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細胞 (NVA)，核染色質(zhì)著橘紅色、核呈現(xiàn)固縮狀;活細胞 (VN)，核染色質(zhì)著綠色、核呈現(xiàn)正常結(jié)構(gòu);非凋亡死亡細胞 (NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色、核呈現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)。隨機在高倍鏡下選取4個視野，分類計數(shù)細胞計算凋亡率，細胞凋亡率=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

1.7.2 Hoechst33258染色 分別把各組神經(jīng)元換回原培養(yǎng)液(即Neurobal培養(yǎng)基500 ml添加B27試劑10 ml;青霉素G 5萬U;鏈霉素5萬U;L－谷氨酰胺1 mmol，pH值7.20)中，在不同時間點以4%多聚甲醛固定，用Hochest33258熒光試劑盒進行Hoechst33258染色，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.8 免疫熒光染色檢測磷酸化JNK1表達 培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元隨機分為3組，每組經(jīng)相應(yīng)的處理后，移去培養(yǎng)基，用冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS)漂洗5次;4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;0.3%Triton X－100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;3%山羊血清封閉30 min，加入磷酸化的JNK1抗體 (濃度為1∶100);標(biāo)本4℃過夜，PBS漂洗后，加入FITC標(biāo)記的二抗 (羊抗兔)作用2 h，PBS漂洗后，Hoechst33258核復(fù)染10 min;熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以 (x－±s)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用方差分析和t檢驗處理數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 在倒置顯微鏡下觀察正常神經(jīng)元呈圓形，均勻分布，折光性良好;24 h后貼壁，胞體漸呈橢圓并開始長出細小突起;3～6 d胞體逐漸變大，形態(tài)為錐形或多邊形，突起逐漸變粗變長與鄰近細胞交織成網(wǎng)狀，亦可見神經(jīng)元聚集;7 d時用NF200測定神經(jīng)元比例為90% ～95%。LPS組的受損細胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)改變，神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹、胞體增大，胞體失去折光性;部分細胞出現(xiàn)空泡，突起破壞、斷裂并出現(xiàn)細胞死亡 (細胞固縮或溶解)(見圖1)。但FSD干預(yù)組的神經(jīng)元仍保持原有形態(tài)學(xué)特征，僅少量神經(jīng)元出現(xiàn)輕度腫脹。與LPS組相比，后者損傷程度明顯減輕。

2.2 LDH活性測定 LPS組細胞培養(yǎng)液中LDH活性較對照組明顯升高，各FSD+LPS組培養(yǎng)液中LDH活性顯著低于LPS組，且隨濃度的增加LDH活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

2.3 神經(jīng)元凋亡檢測結(jié)果

2.3.1 AO/EB熒光染色觀察 AO/EB熒光染色顯示LPS組細胞凋亡率較對照組顯著增高，各FSD+LPS組細胞凋亡率明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1、圖2)。

表1 各組神經(jīng)元凋亡率、培養(yǎng)液LDH活性及JNK1熒光染色表達的平均光密度值 (x－ ±s，n=5)Table 1 Apoptosis rate，LDH activity and the average optical density of JNK1 staining expression in each group neurons

2.3.2 Hochest 33258熒光染色觀察 在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核呈均勻淡染的橢圓形;凋亡細胞核呈亮染的小圓點、不規(guī)則形或新月形。LPS組神經(jīng)元換回原培養(yǎng)液后3 h，染色質(zhì)凝集或斷裂的凋亡細胞開始增多，6 h時明顯增多。換回原培養(yǎng)液后相同時間點，LPS組凋亡細胞較對照組顯著增多，F(xiàn)SD+LPS組凋亡細胞雖較對照組有所增多，但明顯少于LPS組 (見圖3)，與AO/EB熒光染色結(jié)果一致。

2.4 JNK1表達測定結(jié)果 LPS組神經(jīng)元磷酸化JNK1水平明顯增加，各FSD+LPS組可顯著對抗LPS引起的神經(jīng)元磷酸化JNK1水平增加 (見表1)。熒光顯微鏡觀察，對照組正常神經(jīng)元內(nèi)幾乎沒有磷酸化JNKl表達或極少數(shù)表達淺綠色熒光，其余各組神經(jīng)元胞核均呈綠色熒光，細胞核呈陽性。換回原培養(yǎng)液后相同時間點，LPS組神經(jīng)元胞核熒光強度表達較各FSD+LPS組增高，各FSD+LPS組神經(jīng)元熒光強度明顯弱于LPS組(見圖4)。

圖1 正常神經(jīng)元、受損神經(jīng)元形態(tài) (×200)Figure 1 Morphology ofmormal neurons and injury neurons

圖2 各組神經(jīng)元換回培養(yǎng)液后24 h AO/EB熒光染色 (×200)Figure 2 Fluorescein stain of AO/EB in every group 24 hours after retrieving culture solution

圖3 各組神經(jīng)元換回培養(yǎng)液后24 h Hoechst33258熒光染色 (×200)Figure 3 Fluorescein stain of Hoechst33258 in every group 24 hours after retrieving culture solution

圖4 各組神經(jīng)元換回培養(yǎng)液后24 h JNK1熒光染色 (×400)Figure 4 Fluorescein stain of JNK1 in every group 24 hours after retrieving culture solution

3 討論

LPS是一種以氨基苷為組成單位的磷脂，可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞分泌致炎細胞因子如腫瘤壞死因子、白介素－lβ和一氧化氮等多種炎癥因子和毒性物質(zhì)發(fā)揮其毒性作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡［3－4］。本實驗觀察到，LPS對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元具有直接神經(jīng)毒性作用，表現(xiàn)為神經(jīng)元腫大、變性，核固縮或溶解，神經(jīng)元胞膜通透性增加，培養(yǎng)液中LDH水平升高。細胞膜通透性改變是細胞損傷的共同特征，如病理因素持續(xù)存在，就會導(dǎo)致自由基增加、ATP能量耗竭及細胞內(nèi)鈣超載等病理變化，最終使細胞死亡［5］。

本實驗觀察到，F(xiàn)SD對LPS致神經(jīng)元的興奮毒性損傷具有一定的保護作用，可增加體外培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，降低神經(jīng)元的膜通透性。本實驗結(jié)果顯示大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元暴露于10 mg/L LPS后，細胞大小和形態(tài)異常、軸突縮短、突起減少、染色質(zhì)凝集，凋亡細胞明顯增多，細胞膜通透性增加，細胞質(zhì)漏出LDH明顯增多，免疫熒光染色檢測磷酸化JNKl表達顯著增強，提示細胞受損。加入 FSD干預(yù)后，細胞凋亡、LDH漏出、JNKl表達明顯受抑，表明FSD對LPS致神經(jīng)元的興奮毒性損傷具有一定保護作用。這和它抗凋亡、抑制Rho激酶活性、抑制磷酸化JNKl表達上調(diào)相關(guān)，機制可能為:(1)具有抗凋亡及神經(jīng)保護作用［6］，它通過增加還原型輔酶II(NADPH)的形成、拮抗氧自由基、抑制細胞骨架蛋白的分解，起到抗凋亡作用;(2)拮抗谷氨酸鹽對神經(jīng)元的興奮毒性，影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5－羥色胺、多巴胺代謝［7］;通過抑制Rho激酶活性降低神經(jīng)元肌動蛋白網(wǎng)格的穩(wěn)定性，增加神經(jīng)元軸突生長錐的體積和運動性，啟動軸突生長過程［7］。(3)抑制炎性細胞，拮抗炎性因子釋放，阻斷炎性因子的作用，對巨噬細胞、中性粒細胞及單核細胞的聚集、移動、變形、浸潤和吞噬作用有直接的抑制作用［8］;通過減少乳酸的產(chǎn)生，促進其氧化、抑制自由基生成、加速細胞內(nèi)Ca2+的恢復(fù)，解除Rho激酶對肌球蛋白輕鏈磷酸酶的抑制作用，抑制鈣敏化效應(yīng)，從而維持線粒體的正常功能，防止Ca2+相關(guān)性細胞損傷［9］;(4)通過抑制JNK的活性，阻止c－Jun的磷酸化和磷酸化c－Jun在細胞內(nèi)的積聚，阻斷JNK依賴的細胞凋亡及基因轉(zhuǎn)錄，使神經(jīng)元避免或減輕LPS的毒性作用，從而起到保護細胞的作用［10－11］。JNK通路是絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen－activated protein kinases，MAPK)中的一條重要通路，與細胞凋亡密切相關(guān)。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是許多膜受體傳導(dǎo)的生長信號跨膜傳遞的最后共同通路或交匯點，它參與了細胞基質(zhì)、炎癥反應(yīng)、生長因子等重要的信號途徑，并且介導(dǎo)發(fā)育、生長、分化、分裂、凋亡及細胞間相互作用等多種細胞過程。脊椎動物的JNK由JNK1、JNK2和JNK3組成。磷酸化蛋白是MAPK信號通路蛋白SAPK/JNK、P38的活化形式，其被活化后可停留在細胞質(zhì)中，激活其他一系列蛋白激酶，從而使細胞骨架成分磷酸化，也可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進入細胞核激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達，而促進相關(guān)蛋白質(zhì)的合成和蛋白質(zhì)的通道改變，完成其對細胞外刺激的反應(yīng)［12］。本研究用FITC免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)磷酸化JNK1主要是胞核陽性染色。實驗結(jié)果表明LPS可能通過活化磷酸化JNK1，使其進入細胞核內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，誘導(dǎo)非凋亡程序性細胞死亡。

總之，LPS能造成體外培養(yǎng)新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，用FSD預(yù)處理后可以部分逆轉(zhuǎn)上述神經(jīng)毒性作用。但對于FSD的神經(jīng)保護機制，有待進一步深入研究。

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