姚秀宇，姚秀松，王 巍，劉艷杰

糖尿病的發(fā)病率達(dá)10%以上，由此引發(fā)的糖尿病并發(fā)癥高達(dá)30% ～40%［1］，給患者及社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨髓干細(xì)胞在一定條件下可以定向分化為機(jī)體內(nèi)的功能細(xì)胞，形成多種類型的組織和器官以代替損傷和壞死的組織，從而達(dá)到治療疾病的目的［2－3］。目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已在體外成功誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞［4］，許多學(xué)者已經(jīng)找到了體內(nèi)胰島β細(xì)胞分化的相關(guān)因素［5］。本研究采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病足，同時(shí)發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的功能得到恢復(fù)，通過觀察在不同體內(nèi)環(huán)境下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)化的程度是否不同，來尋找體內(nèi)促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，為徹底治愈糖尿病開辟一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年5月—2010年11月選擇采用骨髓干細(xì)胞移植治療的糖尿病足患者125例為研究對(duì)象，診斷均符合1999年世界衛(wèi)生組織 (WHO)制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊呔凶悴亢?(或)下肢發(fā)涼、麻木、疼痛、間歇性跛行;Fontaine分期Ⅱ期80例、Ⅲ期32例、Ⅳ期13例。需要用止痛劑治療13例。以神經(jīng)病變?yōu)橹?0例，血管病變?yōu)橹?0例，混合型45例。心肌缺血125例均存在，血脂異常100例，腦血栓12例。彩色多普勒檢查顯示各段動(dòng)脈不同程度的狹窄或閉塞。術(shù)前采用胰島素控制血糖，根據(jù)血糖控制情況分為兩組;1組為全天血糖完全達(dá)標(biāo) (三餐前血糖＜5.6 mmol/L，餐后2 h血糖＜7.8 mmol/L)63例，其中男40例，女23例;年齡50～70歲，平均年齡62歲。2組為全天血糖均高于正常(三餐前血糖＜9～10 mmol/L，餐后2 h血糖＜12～16 mmol/L)62例，其中男39例，女23例;年齡50～69歲，平均年齡61歲。

1.2 方法 術(shù)前3 d用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 (GCSF)300 U/d肌肉注射，作骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，當(dāng)外周血白細(xì)胞達(dá) (25～30) ×109/L時(shí)，采集骨髓180～200 ml。在手術(shù)室絕對(duì)無菌的條件下，采用硬膜外麻醉，麻醉生效后，取雙髂后上棘后為穿刺點(diǎn)，常規(guī)無菌消毒，鋪無菌手術(shù)孔巾，用16號(hào)骨穿針多部位抽取骨髓液200 ml。送入我科干細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)室。分離后配成一定的濃度，雙下肢多點(diǎn)深部肌肉注射、一部分股動(dòng)脈內(nèi)回輸。骨髓單個(gè)細(xì)胞分離方法:先將骨髓抗凝血用低溫離心機(jī)，溫度22℃、1 500 r/min，離心5 min，吸取少許上浮血漿，將單個(gè)核細(xì)胞層緩慢加入0.077的淋巴細(xì)胞分離液中，放入離心機(jī)中，1 200 r/min，離心20 min，取出后分為5層，吸取中間層，用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，配成一定濃度的懸液，回輸。留2 ml干細(xì)胞懸液，送學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34含量，以推算骨髓干細(xì)胞的數(shù)量。

1.3 評(píng)定方法 觀察患肢的麻木、疼痛感、冷感、間歇性跛行是否好轉(zhuǎn)，同時(shí)檢測(cè)術(shù)后3 d、1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月的餐前及餐后2 h血糖、C－肽值，同時(shí)觀察外用胰島素用量的變化。觀察有無不良反應(yīng)發(fā)生。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用 (x－±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 125例患者均自訴下肢麻木、疼痛感、冷感、間歇性跛行癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 手術(shù)前后兩組血糖變化比較 術(shù)前1組患者餐前和餐后2 h血糖較2組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);術(shù)后3 d、1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月1組與2組患者餐前及餐后2 h血糖比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

2.3 手術(shù)前后兩組胰島素用量變化比較 術(shù)后3 d兩組患者胰島素用量較術(shù)前均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。術(shù)前1組患者胰島素用量較2組無明顯降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);術(shù)后3 d、1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月2組患者胰島素用量較1組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

2.4 手術(shù)前后兩組血C－肽水平變化比較 兩組患者術(shù)前、術(shù)后3 d、1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月餐前和餐后2 h血C－肽水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表3)。2.5不良反應(yīng) 兩組患者均無嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

表1 手術(shù)前后兩組血糖變化比較 (x－±s，mmol/L)Table1 Comparison of change contrast of blood sugar before and after operation in two groups

表3 手術(shù)前后兩組血C－肽水平變化比較 (x－±s，μg/L)Table 3 Comparison of change contrast of blood C－peptide levels in two groups before and after surgery

表2 手術(shù)前后兩組胰島素用量變化比較 (x－±s，U/d)Table 2 Comparison of change contrast of the insulin dose in two groups before and after surgery

3 討論

目前在損傷的內(nèi)分泌胰腺的治療研究中，骨髓來源的干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、器官來源的干細(xì)胞均有作用［6］。最重要的是如何誘導(dǎo)出具有完全功能的胰島樣細(xì)胞，即具有雙相胰島素釋放功能，可以動(dòng)態(tài)模擬生理狀態(tài)下的胰島素分泌。目前相關(guān)的研究證實(shí)，葡萄糖對(duì)胰島β細(xì)胞的再生有雙重作用［7］，血糖略高于正常時(shí)可以促進(jìn)干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞，血糖極高時(shí)促使胰島本身的β細(xì)胞凋亡［8］?；罨慕z－蘇氨酸激酶(PBK)使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子定位于β細(xì)胞表面，葡萄糖通過轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)酵解使ATP/ADP及磷酸鹽濃度升高，進(jìn)而ATP依賴的K通道關(guān)閉，質(zhì)膜去極化，電壓依賴式L型鈣通道激活，胞內(nèi)Ca2+濃度升高促進(jìn)胰島素分泌。但較長(zhǎng)時(shí)間的高濃度葡萄糖，又可通過調(diào)整不同的基因程序使β細(xì)胞產(chǎn)生關(guān)鍵表型的改變而致β細(xì)胞功能缺陷、去分化及最終致β細(xì)胞死亡。對(duì)于未分化細(xì)胞，葡萄糖可充當(dāng)有絲分裂劑，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β細(xì)胞加入5%～25%葡萄糖，隨濃度上升分裂增殖加快。文獻(xiàn)分析可能由于正常的葡萄糖濃度可使葡萄糖調(diào)節(jié)基因正?；?，恢復(fù)葡萄糖調(diào)節(jié)敏感性，有利于β細(xì)胞表型正?；木S持，高血糖在原始細(xì)胞階段可誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞分化及胰島素分泌［9］。本研究結(jié)果顯示，血糖略高于正常的患者，術(shù)后胰島素用量明顯減少，血糖完全正常組胰島素用量減少不明顯，兩組有顯著性差異。兩組術(shù)后血糖變化不大，考慮與兩組術(shù)前血糖控制差別很小有關(guān)，術(shù)后兩組血糖均控制在正常范圍，但胰島素用量明顯不同。高糖毒性解除后，胰島β細(xì)胞的功能都應(yīng)有所恢復(fù)，術(shù)前血糖略高組胰島素用量明顯減少，說明干細(xì)胞部分轉(zhuǎn)化為胰島β細(xì)胞。血C－肽值術(shù)后兩組均有上升，但無顯著性差異，可能是由于本研究選擇的兩組患者術(shù)前均有部份殘存的胰島β細(xì)胞。術(shù)后兩組餐前、餐后血糖均在參考范圍，是造成術(shù)后血C－肽沒有顯著性差異的主要原因。但胰島素用量不同，說明了胰島β細(xì)胞恢復(fù)的程度不同。高葡萄糖可以誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為胰島β細(xì)胞，但對(duì)自身的胰島β細(xì)胞又有促凋亡的作用，本研究認(rèn)為最好將血糖控制在略高于正常的水平，有利于干細(xì)胞的分化，同時(shí)也有利于自身胰島β細(xì)胞的修復(fù)，對(duì)自身干細(xì)胞的作用可能是自體干細(xì)胞移植時(shí)，有部分造血干細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)殘存β細(xì)胞有修復(fù)作用。研究顯示除葡萄糖外還有許多相關(guān)的因素可以促進(jìn)β細(xì)胞分化，文獻(xiàn)報(bào)道有尼可酰胺、維甲酸、丁酸鹽類、shh抑制劑、活化素 (Activin)、胰高血糖素樣肽 (GLP)及其類似物等，均可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞［10］，這些因素是否能夠成為干細(xì)胞移植后體內(nèi)轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，干細(xì)胞來源廣泛，取材方便，在不同的理化環(huán)境下及細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下具有多向分化的潛能，是組織工程、細(xì)胞移植及基因治療領(lǐng)域的理想靶細(xì)胞，但體外培養(yǎng)再回輸變數(shù)太大，如果可以找到體內(nèi)誘導(dǎo)的方法，安全系數(shù)將明顯提高。

1 Docherty K.Growth and developmentof theisletsof Langerhans:implications for the treatment of diabetesmellitus［R］．Cur Opin pharmacol，2001，1(2):641－650.

2 Shapiro J，Lakey JRT，Ryan EA，et al.Islet transplantation in seven patientswith type Idiabetesmellitus using a glucocorticoid－free immunosuppressive regimen ［J］．N Enegl JMed，2000，343(9):230－238.

3 Soria B，Roche E，Berana G，et al.Insulin－secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin－induced diabeticmice［J］．Diabetes，2000，49(7):1－6.

4 Han TL，Chiou SH，Chung LK，et al.Characterization of pancreatic stem cells derived from adulthuman pancreas duts by fluore－scence activated cell sorting，world ［J］．J Gastroenterol，2006，28(6):4529－4535.

5 Tang DQ，Li ZC，Brant R，etal.In vivo and in vitro characterization of insulin－priducing cell obtained from murine bonemarrow ［J］．Diabetes，2004，53(4):1721 －1732.

6 Voltarelli JC，CouriCE，Stracieri AB，etal.Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type Idiabetesmeliitus［J］．JAMA，2007，297(14):1568－1576.

7 賈延頡，鐘樂，寧建輝，等.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞［J］．中國(guó)當(dāng)代兒科雜，2003，5(3):393－397.

8 付漢東，張愛華，魯艷，等.自體骨髓干細(xì)胞移植治療糖尿病足患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及意義［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13(8):2554.

9 李艷華，白慈賢，謝超，等.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的研究［J］．自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13(6):593－597.

10 Moriscot C，F(xiàn)raipont F，Richard MJ，et al.Human bonemarrow mesenchymal stem cells can express insulin and key transcription factors of the endocrine pancreas developmental pathway upon genetic and/ormicroenvironmental manipulation in vitro ［J］．Stem cells，2005，23(4):594－603.