劉 逾，賈曉林，李進軍，盧立志，劉曉玲

視網(wǎng)膜色素變性 (Retinitis pigmentosa，RP)是視網(wǎng)膜感光細胞退化、視網(wǎng)膜色素上皮變性、外層視網(wǎng)膜進行性退化所致的常見遺傳性致盲眼底病。在世界范圍內(nèi)該病發(fā)病率約為1/3 500［1］，我國群體患病率約為 1/3 784［2］，且呈逐年上升趨勢，已成為臨床上最常見且危害最嚴重的致盲性眼遺傳病之一。RP的遺傳方式復雜多樣，非綜合征RP中至少有4種遺傳方式，其中30%為常染色體顯性遺傳 (ADRP)，20%為常染色體隱性遺傳 (ARRP)，15%為X連鎖遺傳 (XLRP)，另有5%早發(fā)型RP即隱性Leber's先天性黑蒙 (LCAⅡ型)。當患者因缺乏家族史而無法確定其遺傳方式時，將其定義為散發(fā)型RP(SRP)，約占30%［3］。多數(shù)RP為單基因遺傳，但也存在二基因－雙等位基因和二基因－三等位基因遺傳方式［4］。迄今為止，通過連鎖分析和候選基因篩選等方法已確定了19個ADRP、27個ARRP和6個XLRP基因位點，其中35個基因已被克隆。視紫紅質(zhì) (RHO)基因是最早發(fā)現(xiàn)的ADRP致病基因，同時也是 ADRP患者最常見的致病基因。大約26.5%的ADRP患者由RHO基因突變引起［3］，亞洲報道的突變率低于歐美，我國ADRP患者約有7%由RHO基因突變引起［5］。文獻報道RHO基因突變也可導致ARRP，不過發(fā)生頻率較小，不足1%［6］。為進一步明確RHO基因在中國人中的突變特征與頻率，本研究對收集的RP患者進行RHO全基因多聚酶鏈式反應 (PCR)擴增，直接雙向測序及基因突變檢測分析，以期獲得中國RP患者RHO基因突變頻率及特征，探討其在RP發(fā)病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年3月—2010年10月溫州醫(yī)學院附屬眼視光醫(yī)院門診收治的55例RP先證者為研究對象，均為漢族，男31例，女24例，初診年齡5～71歲，平均年齡35歲，其中ADRP 6例、ARRP 14例、SRP 35例，分布于中國華南地區(qū)。RP診斷的確立依據(jù)國內(nèi)外通用標準:(1)夜盲史;(2)視力逐漸下降;(3)眼底檢查可見骨細胞樣或不規(guī)則的色素沉著，視網(wǎng)膜血管縮窄和視盤顏色蠟黃或變淡;(4)全視野視網(wǎng)膜電圖 (ERG)明、暗視活動時，桿體細胞功能降低，有時可見錐體細胞功能輕度降低，晚期桿體、錐體細胞功能均可降低。(5)視野縮窄或有環(huán)行暗點特征性改變和 (或)適應曲線閥值升高，或視網(wǎng)膜桿體相缺如［7］。同時本研究隨機收集55名健康成年人為對照組，其中男35例，女20例，年齡18～50歲，平均年齡32歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床研究 全面調(diào)查病史并繪制家系圖，進行詳細的眼科檢查，行ERG及視野檢查。

1.2.2 樣品采集 對RP患者及對照者行全面系統(tǒng)檢查，排除其他系統(tǒng)疾病，采集靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝、－70℃保存。根據(jù)世界醫(yī)學會《赫爾辛基宣言》涉及人類受試者的醫(yī)學研究的倫理原則及知情同意原則，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2.3 RP組DNA提取 采用蛋白酶K法提取白細胞DNA，干燥回收的DNA用TE緩沖液溶解備用，－20℃保存。

1.2.4 引物設計 運用primer 5.00軟件 (PREMIER Biosoft International)對RHO基因序列 (Genbank NC_000003.11)進行引物設計，擴增RHO基因全序列，交上海英俊生物技術(shù)公司合成 (見表1)。

表1 RHO基因PCR引物堿基序列Table 1 PCR primer sequences for the RHO gene

1.2.5 PCR反應 PCR反應體系:10×Buffer 2.5μl，MgCl2(含 MgCl210 mmol/L)1.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μl，ExTaq(5 U/μl)0.25μl，上下游引物 (10 mmol/L)各0.4 μl，DNA模板1.5μl，加超純水至25μl。PCR反應條件:95℃預變性4 min，95℃變性30 s，63.5～66.0℃退火40 s，72℃延伸150 s，35個循環(huán)，后72℃延伸10min。PCR反應均在德國Biometra儀器上進行，反應試劑均來自大連寶生物公司(TaKaRa公司)。PCR反應結(jié)束后，將反應產(chǎn)物進行2%瓊脂糖電泳，同時加Maker標記DNA相對分子量，透射紫外線觀察DNA電泳帶凝膠成像儀照相，計算機分析結(jié)果，以證實該擴增片段。

1.2.6 DNA測序分析 對擴增出的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后進行直接的正、反雙向測序分析 (上海英俊生物技術(shù)公司ABI3170自動測序儀)。采用Chromas2.31軟件查看測序結(jié)果，并采用DNAStar軟件 (DNAStar version 6，0，3，99)進行比對分析。突變的命名參照國際統(tǒng)一的人類基因突變命名系統(tǒng)［8］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。多重比較的P值由Bonferroni檢驗校正。采用χ2檢驗對每一個檢測到的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)是否符合Hardy－Weinberg平衡進行分析?；蛐皖l率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物 所有研究對象DNA經(jīng)PCR擴增及2%瓊脂糖凝膠電泳后，均顯示單一條帶，所擴增的片段長度與預期一致，表明是所需的產(chǎn)物 (見圖1)。

2.2 DNA測序及分析結(jié)果 應用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)，采用Chromas2.31軟件查看測序結(jié)果，測序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件進行比對分析 (見圖2)，共檢出7種堿基變異，均符合Hardy－Weinberg平衡。其中2種為錯義突變，V104I僅在RP組出現(xiàn)，A299S在RP組及對照組中各有1例。其余5種為非編碼區(qū)突變，且在對照組中也發(fā)現(xiàn)相應堿基突變，考慮為SNP，在NCBI－SNP數(shù)據(jù)庫中進行檢索，兩組各SNP位點突變頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 檢出的RHO基因點突變Table 2 RHO sequence alterations detected in the study

圖1 PCR擴增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of agarose gel amplified by PCR

圖2 先證者RHO基因7個突變序列和對照者RHO基因7個堿基位點測序結(jié)果Figure 2 A graph of7mutation sequence of rhodopsin gene in proband and graph of 7 bases of rhodopsin gene in normal control

3 討論

RHO基因位于人染色體3q21～24，由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，編碼一個由348個氨基酸組成的視蛋白，這是一個在視覺光電轉(zhuǎn)化過程中起作用的G－蛋白偶聯(lián)受體。RHO基因突變導致結(jié)構(gòu)異?；蛱腔淖兊囊暤鞍椎漠a(chǎn)生，該蛋白滯留在感光細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不能運輸?shù)揭晽U細胞外節(jié)盤膜中，或者該視蛋白由于結(jié)構(gòu)異常不能折疊，而不能整合入盤膜或引起盤膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而發(fā)生變性，導致RP［9］。自1990年Thaddeus等［10］報道RHO基因突變與某些 ADRP的發(fā)病有關(guān)以來，目前已發(fā)現(xiàn)100余種RHO基因突變，其中約90%為單個堿基置換的點突變，改變了RHO蛋白分子的單個氨基酸而致病，少數(shù)是微小缺失或插入突變。

本研究在1例SRP患者和1例ADRP患者中檢出錯義突變V104I，對照組55名健康成年人未檢出此突變。Macke等［11］曾通過家系分析報道該突變?yōu)榉侵虏〉腻e義突變。本研究在1例42歲男性ADRP患者及1例對照者RHO基因上檢出錯義突變A299S。張曉莉等［12］曾報道在1例RP患者及2例正常對照組成員中檢出該突變，也系非致病的錯義突變。迄今為止國內(nèi)外已報道的非致病錯義突變共3個，除本研究檢出的V104I、A299S外，另一個相似突變?yōu)镻220L［10］。文獻報道65種脊椎動物的RHO蛋白中有27種第299位氨基酸為丙氨酸［13］，其余均為絲氨酸［14］，而絲氨酸也可以看做是丙氨酸的羥基化形式，以此解釋A299S突變在RHO基因上屬正常的多態(tài)變化，但對于其他兩種非致病錯義突變的機制尚無文獻報道。這些錯義突變改變了RHO基因的氨基酸序列，引起RHO分子結(jié)構(gòu)和功能異常，雖然已有家系報道為非致病突變，但其機制不明。本研究未檢出其他錯義突變，我們預測RHO基因在中國華南地區(qū)RP患者中的突變率較低。

除錯義突變，本研究在RHO非編碼區(qū)檢出多個突變位點，在NCBI－SNP數(shù)據(jù)庫中檢索均為已報道的SNP位點，RP組與對照組各SNP位點發(fā)生頻率均無顯著差異。RP遺傳學機制復雜，其候選基因確切致病機制及相互作用關(guān)系尚不清楚。隨著分子生物學的進展，人們認為在內(nèi)含子與外顯子交界處的內(nèi)含子突變會導致外顯子的缺失或內(nèi)含子不被剪切，發(fā)生在內(nèi)含子中間的變異也多會因為激活了隱性剪切位點而影響了正常剪切從而致病［15］。王丹藝等［16］對151例香港地區(qū)漢族 RP先證者和150例對照者進行了RHO基因和RP1基因全編碼區(qū)和鄰近剪切位點的內(nèi)含子區(qū)域序列突變的檢測。發(fā)現(xiàn)RHO基因非編碼區(qū)－26G＞A突變僅在RP組中出現(xiàn)，其發(fā)生率在RP組中顯著高于對照組，提示SNP與RP的危險性增加有關(guān)。本研究中也檢出－26G＞A突變，但其在RP組和對照組中的發(fā)生率無顯著差異。雖然本研究所檢測出的非編碼區(qū)突變與對照組差異不顯著，但仍然應該對內(nèi)含子在RP發(fā)病機制中所起的作用引起重視。迄今人們對RP的研究和認識越來越多［17］，特別是對內(nèi)含子及其功能、發(fā)生在內(nèi)含子的基因突變與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)性的研究給RP的遺傳病因?qū)W研究帶來了全新的概念。如果發(fā)生在內(nèi)含子的基因突變與RP發(fā)病的相互作用被證實，對于RP的發(fā)病機制將有更進一步的認識。

本研究檢出兩種已報道的非致病錯義突變，5種非編碼區(qū)SNP位點，未發(fā)現(xiàn)新的錯義突變，我們由此預測RHO基因在中國華南地區(qū)RP患者中的突變率低于國外報道。本研究尚有不足之處，首先樣本量較小，沒有發(fā)現(xiàn)新的突變位點，其次未對檢出錯義突變的先證者進行進一步家系研究，以確定檢出的錯義突變在該先證者家系中是否垂直傳遞，僅能參考文獻報道。進一步研究應盡可能的擴大樣本量，爭取全基因組檢測，對檢測錯義突變患者進行家系研究，以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點。

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