談鈺培，鐘丹妮Δ，趙 科，謝湘芝

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021；2.環(huán)江毛南族自治縣人民醫(yī)院兒科，河池 547199）

新生兒高膽紅素血癥（新生兒高膽）是新生兒期常見(jiàn)癥狀，大約80% 早產(chǎn)兒和50% 足月兒出生后會(huì)發(fā)生高膽紅素血癥[1]，其發(fā)病與新生兒早期體內(nèi)膽紅素—尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）表達(dá)水平低有關(guān)。UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)基因突變均可導(dǎo)致該酶活性降低或缺失，使游離膽紅素的葡萄糖醛酸化過(guò)程受阻，膽紅素代謝減少引起血清中游離膽紅素水平升高，導(dǎo)致新生兒高膽。UGT1A1基因最常見(jiàn)突變類(lèi)型為啟動(dòng)子區(qū)TATA盒插入突變和G71R錯(cuò)義突變，亞洲地區(qū)的黃種人常見(jiàn)為第1 外顯子區(qū)G71R 錯(cuò)義突變?yōu)橹鱗2-5]，歐美地區(qū)高加索人及Gilbert綜合征常見(jiàn)為啟動(dòng)子區(qū)TATA盒插入突變?yōu)橹鱗6-9]。本研究旨在探討不明原因新生兒高膽與UGT1A1基因編碼啟動(dòng)子區(qū)TATA盒和第1外顯子區(qū)基因突變類(lèi)型的關(guān)系，以便為明確不明原因新生兒高膽的病因及診治提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021 年1～12 月在廣西環(huán)江毛南族自治縣人民醫(yī)院新生兒科和產(chǎn)科住院的新生兒，足月（胎齡≥37 周）出生，出生體重2 500～4 000 g。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患兒家屬知情同意。

1.2 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 病例組：（1）黃疸發(fā)病日齡在2周內(nèi)，血清膽紅素升高且以游離膽紅素升高為主，時(shí)齡血清總膽紅素值達(dá)到或超過(guò)2014年《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》[10]的新生兒小時(shí)膽紅素列線(xiàn)圖光療標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)光療及藥物治療黃疸好轉(zhuǎn)出院。對(duì)照組：（1）出生后無(wú)明顯黃疸或血清總膽紅素值低于2014年《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》[10]的新生兒小時(shí)膽紅素列線(xiàn)圖光療標(biāo)準(zhǔn)；（2）均與高膽紅素血癥組同期、同地區(qū)出生，未經(jīng)特殊治療，臨床經(jīng)過(guò)良好。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 病例組和對(duì)照組均排除：（1）早產(chǎn)兒；（2）低出生體重兒；（3）足月小樣兒；（4）巨大兒；（5）先天畸形者；（6）母嬰血型不合導(dǎo)致的溶血者；（7）G6PD缺乏癥者；（8）消化道畸形者；（9）紅細(xì)胞增多癥者；（10）敗血癥等病因明確的影響黃疸程度的因素。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及DNA 提取 采集靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，應(yīng)用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，于-20℃保存。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)。引物序列，上游引物：5’-GTC ACG TGA CAC AGT CAA AC-3’，下游引物：5’-GTC CCA CTC CAA TAC ACA C-3’，擴(kuò)增片段為啟動(dòng)子區(qū)TATA盒及全部第1外顯子，片段長(zhǎng)度987 bp。（引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成）。反應(yīng)體系：2xEs Taq MasterMix（Dye）（康為世紀(jì)公司）25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 200 ng，去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)在多通道PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次，72 ℃再延伸2 min。產(chǎn)物置于4℃保存。

1.3.3 凝膠電泳 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為擴(kuò)增目的基因片段，以100 bp Ladder DNA Marker（康為世紀(jì)公司）作為片段大小參照物，每例PCR產(chǎn)物取5 μL，電壓120 V，電泳30 min。在紫外凝膠成像系統(tǒng)上對(duì)凝膠進(jìn)行成像顯影并觀察。

1.3.4 基因測(cè)序 將合格的PCR 產(chǎn)物在1～2 d 寄送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組出生胎齡、出生體重及總膽紅素值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組性別構(gòu)成、分娩方式、基因型分布及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。二分類(lèi)變量非條件Logistic 回歸分析比較UGT1A1基因不同突變類(lèi)型對(duì)不明原因新生兒高膽影響的優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組出生胎齡、出生體重、性別構(gòu)成及分娩方式比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；病例組總膽紅素值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物呈單一條帶，片段大小與目的基因相符，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3UGT1A1基因測(cè)序結(jié)果及分析

2.3.1 啟動(dòng)子區(qū) 在UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)共發(fā)現(xiàn)TATA盒（TA）7插入突變33例，其中病例組16例，對(duì)照組17例；在病例組中發(fā)現(xiàn)A（TA）6TAA/A（TA）7TAA[簡(jiǎn)稱(chēng)（TA）6/7）]雜合插入突變14 例，A（TA）7TAA/A（TA）7TAA[簡(jiǎn)稱(chēng)（TA）7/7]純合插入突變2例；對(duì)照組全部為（TA）6/7插入突變?？偛迦胪蛔兊幕蝾l率分別為9.0%、8.5%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表2。

圖2 UGT1A1 TATA盒插入突變位點(diǎn)測(cè)序圖（正向測(cè)序）

表2 兩組UGT1A1 TATA盒基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

2.3.2 第1 外顯子區(qū) 在UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)G71R 錯(cuò)義突變43 例，其中病例組33 例，對(duì)照組10 例；在病例組中發(fā)現(xiàn)雜合子（G/A）29 例，純合子（A/A）4例；對(duì)照組全部為雜合子?？傚e(cuò)義突變的等位基因頻率分別為18.5%、5.0%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，病例組G71R 基因型分布及等位基因頻率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖3、表3。

表3 兩組UGT1A1 G71R基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

圖3 UGT1A1 G71R錯(cuò)義突變位點(diǎn)測(cè)序圖（正向測(cè)序）

在UGT1A1基因第1外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)P229Q錯(cuò)義突變8例，其中病例組3例，對(duì)照組5例；病例組和對(duì)照組均為雜合子（C/A）?？傚e(cuò)義突變的等位基因頻率分別為1.5%、2.5%，比較兩組基因型分布和等位基因頻率，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4、表4。

圖4 UGT1A1 P229Q錯(cuò)義突變位點(diǎn)測(cè)序圖（反向測(cè)序）

表4 兩組UGT1A1 P229Q基因型分布和等位基因頻率比較n（%）

2.3.3UGT1A1基因不同突變類(lèi)型對(duì)不明原因新生兒高膽影響的Logistic回歸分析 采用二分類(lèi)變量非條件Logistic回歸分析本研究發(fā)現(xiàn)的TATA盒、G71R 和P229Q 這3 個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)不明原因新生兒高膽紅素血癥的影響，發(fā)現(xiàn)本研究中UGT1A1G71R錯(cuò)義突變是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素（P＜0.001），新生兒攜帶有G71R 錯(cuò)義突變發(fā)生不明原因新生兒高膽紅素血癥是野生型的4.540 倍。而UGT1A1TATA 盒（TA7）插入突變和P229Q 錯(cuò)義突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素（P＞0.05），表5。

表5 UGT1A1基因不同突變類(lèi)型對(duì)不明原因新生兒高膽影響的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

UGT1A1由第1外顯子和第2～5共同外顯子編碼。體外研究顯示只有UGT1A1 酶結(jié)合底物是膽紅素，該酶為肝臟內(nèi)膽紅素代謝的唯一酶[12]。除了已明確黃疸病因外，不明原因新生兒高膽發(fā)病常常與UGT1A1基因突變有關(guān)，全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因突變類(lèi)型有300 余種，突變方式包括插入突變、錯(cuò)義突變、缺失突變等。

本研究結(jié)果顯示，兩組中UGT1A1基因突變類(lèi)型以G71R錯(cuò)義突變?yōu)橹?，比較兩組G71R等位基因頻率，病例組的等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示G71R 錯(cuò)義突變可能與不明原因新生兒高膽發(fā)生有關(guān)系，這與本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果相符[13]。結(jié)合Logistic 回歸分析，UGT1A1G71R錯(cuò)義突變是不明原因新生兒高膽發(fā)生的危險(xiǎn)因素。UGT1A1G71R 錯(cuò)義突變?yōu)閁GT1A1基因第1外顯子區(qū)的第211位堿基由G突變?yōu)锳，使該編碼的密碼子由甘氨酸（GGA）變?yōu)榫彼幔ˋGA），使UGT1A1的葡萄糖醛酸化能力下降，引起新生兒高膽。本研究病例組G71R等位基因頻率高于廣西黑衣壯族地區(qū)（15.5%）[14]、低于廣西來(lái)賓地區(qū)不同民族間（19.0%、27.0%、20.0%）[15]、云南?。?3.0%）[16]、廣東漢族（29.2%）[17]、重慶地區(qū)（42.4%）[18]、越南（27.3%）[19]、日本（47.0%）[4]等。

UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)TATA 盒已知突變類(lèi)型為（TA）5、（TA）7、（TA）8 三種類(lèi)型。在本研究中發(fā)現(xiàn)UGT1A1TATA盒以（TA）7插入突變?yōu)橹鳎渫蛔冾l率僅次于G71R 錯(cuò)義突變，比較兩組（TA）7 等位基因頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示（TA）7插入突變可能與不明原因新生兒高膽紅素血癥發(fā)生無(wú)關(guān)系，這與Akaba 等[2]報(bào)道過(guò)UGT1A1TATA 盒（TA）7 插入突變不是亞洲地區(qū)引起新生兒黃疸的主要突變類(lèi)型是一致的。結(jié)合Logistic 回歸分析結(jié)果，提示（TA）7插入突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素。Beutler 等[8]曾報(bào)道（TA）7插入突變?cè)诎兹巳后w中的基因頻率為38.7%，在亞洲人群中僅為16.0%，只有在非洲血統(tǒng)的人群中才發(fā)現(xiàn)有（TA）5和（TA）8突變類(lèi)型。本研究中病例組（TA）7等位基因頻率低于廣西黑衣壯族地區(qū)（13.0%）[14]、亞洲人群（16.0%）[8]。

本研究在UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)8例P229Q雜合突變，并同時(shí)存在有TATA盒插入突變，其中1 例為A（TA）7/7TAA-P229Q，另外7 例均為A（TA）6/7TAA-P229Q，比較兩組P229Q 等位基因突變頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P229Q 錯(cuò)義突變可能與不明原因新生兒高膽發(fā)生無(wú)關(guān)系。結(jié)合Logistic 回歸分析結(jié)果提示UGT1A1P229Q 錯(cuò)義突變不是不明原因新生兒高膽的危險(xiǎn)因素。Osamu等[20]報(bào)道過(guò)UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)存在P229Q錯(cuò)義突變（UGT1A1*27），是引起日本Gilbert綜合征（GS）和Crigler NajjarⅡ型（CN Ⅱ）患者UGT1A1酶活性下降引起高膽紅素血癥。中國(guó)臺(tái)灣也曾報(bào)道過(guò)A（TA）6/7TAA-P229Q 的等位基因雜合突變使UGT1A1 酶活性減少，臨床表現(xiàn)為Gilbert 綜合征[21]。Kaniwa 等[9]提出在A（TA）6/7TAA-P229Q 的等位基因雜合突變的日本和中國(guó)臺(tái)灣患者中觀察到的高膽紅素血癥可主要?dú)w因于TATA盒（TA）7插入突變。這提示P229Q 錯(cuò)義突變對(duì)不明原因新生兒高膽影響不大，由于本研究中發(fā)現(xiàn)P229Q錯(cuò)義突變例數(shù)較少，之后需要加大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究探討了不明原因新生兒高膽和正常新生兒在UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)及第1外顯子區(qū)的突變情況，分析所檢測(cè)到的突變類(lèi)型與不明原因新生兒高膽發(fā)生的關(guān)系，明確UGT1A1G71R 錯(cuò)義突變與不明原因新生兒高膽發(fā)生有關(guān)系，是其危險(xiǎn)因素，攜帶有該基因錯(cuò)義突變可能會(huì)增加新生兒高膽的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為今后不明原因新生兒高膽發(fā)生發(fā)展提供基因遺傳學(xué)證據(jù)。