吳志平，趙曉昆，呂 晨，楊明根，肖 寧

細(xì)胞間隙連接 (gap junction，GJ)是普遍存在于動(dòng)物組織細(xì)胞間的一種通訊方式，主要由間隙連接蛋白 (connexin，Cx)所構(gòu)成。細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間隙連接通訊 (gap junction intercellular communication，GJIC)進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)的傳遞，調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝、增殖、分化等生理過(guò)程，對(duì)機(jī)體的代謝平衡及生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義［1］。研究發(fā)現(xiàn)GJ與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，其中Cx43是一種主要的細(xì)胞間隙連接蛋白，在多種癌細(xì)胞中都有Cx43表達(dá)的下降，是研究的熱點(diǎn)［2］。本研究通過(guò)半定量RT－PCR的方法檢測(cè)Bcl－2 mRNA，BaxmRNA及Cx43mRNA在膀胱移行細(xì)胞癌 (BTCC)組織中的表達(dá)，探討Cx43基因與凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其生物學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年6月—2008年6月中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的BTCC患者新鮮組織標(biāo)本35例，癌組織取腫塊非壞死部分。選擇同期BTCC患者距腫瘤邊緣2 cm的癌旁組織21例、正常膀胱組織15例，其中良性前列腺增生手術(shù)取正常膀胱組織9例，BTCC患者手術(shù)取距腫瘤邊緣＞5 cm膀胱組織6例。35例BTCC患者術(shù)前均未行任何放、化療，其中男21例，女14例;年齡38～72歲，平均 (58.6±10.2)歲;初發(fā)腫瘤23例，復(fù)發(fā)腫瘤12例;腫瘤單發(fā)21例，多發(fā)14例;腫瘤直徑＜3 cm 18例，≥3 cm 17例;腫瘤分期:Ta～1期24例，T2～4期11例;腫瘤分級(jí)G1級(jí)15例，G2級(jí)11例，G3級(jí)9例。

1.2 主要試劑 Bcl－2、Bax、Cx43和人肌動(dòng)蛋白 (β－actin)引物由上海生工生物工程公司合成，RT－PCR試劑盒(兩步法)購(gòu)自Promega公司，PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs試劑購(gòu)自Takara公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有標(biāo)本 (腫瘤組織、癌旁組織，正常膀胱組織)經(jīng)－196℃液氮罐取回并置于－70℃冰箱保存。

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Bcl－2、Bax、Cx43、β－actin的mRNA序列 (genebank序列號(hào)NM_000633、NM_138764、NM_000165、NM_001101)，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer3設(shè)計(jì)相關(guān)引物 (見(jiàn)表1)。

1.3.2 組織標(biāo)本總RNA的提取與鑒定 各種標(biāo)本分別取50～100 mg組織，用勻漿器將組織徹底勻漿后，在冰上加入1 ml Trizol，提取組織總RNA，提取步驟參照Trizol試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Trizol提取組織總RNA的吸光度比值 (即OD260/OD280值)均達(dá)1.7～1.9。

1.3.3 半定量RT－PCR檢測(cè) RT－PCR按照TaKaRa兩步法試劑盒的說(shuō)明操作，以O(shè)ligo－dT為引物反轉(zhuǎn)錄cDNA模板后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s3 min，循環(huán)30次，再72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，分別取5 ml產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定標(biāo)本的灰度值，重復(fù)3次并計(jì)算Bcl－2、Bax及Cx43與β－actin的表達(dá)比值來(lái)判斷 Bcl－2 mRNA、Bax mRNA及Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 mRNA序列引物設(shè)計(jì)Table 1 mRNA sequence of primer design

1.3.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST比較分析 分別用合成的引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用DNASTAR軟件中的Seqman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，證實(shí)RT－PCR產(chǎn)物與目的mRNA序列是否同源。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用 (x－±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA在BTCC、癌旁組織及正常膀胱組織中的表達(dá) RT－PCR擴(kuò)增3種組織中的Cx43、Bcl－2、Bax基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。分析其表達(dá)水平 (OD比值):Cx43/β－actin、Bcl－2/β－actin及Bax/β－actin。3種組織中Cx43mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，其中BTCC組織中Cx43 mRNA的表達(dá)低于癌旁組織及正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。Bcl－2 mRNA在BTCC組織高表達(dá)，而在癌旁組織及正常膀胱組織中表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。BaxmRNA在BTCC組織、癌旁組織及正常膀胱組織中的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);癌旁組織與正常膀胱組織中，Cx43 mRNA和Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表2)。

表2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA在組織中的表達(dá) (x－±s，OD比值)Table2 The expression of Cx43mRNA，Bcl－2mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

圖1 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA和BaxmRNA在組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

2.2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA表達(dá)水平與BTCC臨床病理特征的關(guān)系 Cx43 mRNA的表達(dá)水平在BTCC不同的病理分級(jí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，而與患者的腫瘤分期和腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平在BTCC不同的病理分級(jí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。復(fù)發(fā)BTCC組織中Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平高于初發(fā)癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平與患者的腫瘤分期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。BaxmRNA的表達(dá)水平與BTCC患者的腫瘤分期、病理分級(jí)、腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表3)。

2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST分析 分別用合成的引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用DNASTAR軟件中的Seqman II對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，證實(shí)Cx43、Bcl－2和Bax RT－PCR產(chǎn)物與目的基因Cx43、Bcl－2、BaxmRNA序列完全一致 (見(jiàn)圖2)。

表3 Cx43 mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA的表達(dá)與BTCC臨床病理特征的關(guān)系 (x－±s，OD比值)Table 3 Relation of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA expression with the clinicopathologic features of BTCC

圖2 Cx43、Bcl－2、Bax和β－actin基因RT－PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Figure 2 The sequencing results of Cx43，Bcl－2，Bax andβ－actin gene by RT－PCR

3 討論

GJ是普遍存在于動(dòng)物組織細(xì)胞間的一種通訊方式，相鄰細(xì)胞間通過(guò)GJIC進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)的傳遞及信息和能量物質(zhì)的交換，調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝、增殖、分化等生理過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用，而對(duì)機(jī)體的代謝平衡及生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義［1］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中普遍存在著Cx表達(dá)異常和GJIC功能缺陷［3］，提示GJIC與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。GJ主要由Cx構(gòu)成，Cx是一個(gè)多成員、發(fā)育上保守的大家族，目前命名的人類(lèi)Cx家族成員已達(dá)21個(gè)［4］。其中 Cx43是一種主要的Cx，是間隙連接蛋白家族中分布最廣、研究最多的成員，其基因表達(dá)的產(chǎn)物是一種磷酸化蛋白。Wilgenbus等［5］通過(guò)人腫瘤組織的冷凍切片，以免疫組織化學(xué)方法研究乳腺癌、腎細(xì)胞癌和肉瘤組織中 Cx26、Cx32和 Cx43的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) Cx26、Cx32和Cx43水平明顯下降。范松青等［6］通過(guò)對(duì)不同癌組織和癌旁組織Cx43表達(dá)的研究，認(rèn)為Cx43表達(dá)的缺乏或下調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，Cx43 mRNA在正常膀胱組織有很高的表達(dá)率，說(shuō)明Cx43基因產(chǎn)物在正常膀胱組織內(nèi)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等生理過(guò)程，對(duì)正常膀胱組織功能的維持起著重要作用。Cx43 mRNA在BTCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于正常膀胱組織及癌旁組織，Cx43在BTCC中的弱表達(dá)，表明Cx43表達(dá)下降，功能性GJ通道形成減少，故GJIC功能減弱或被抑制，使來(lái)自正常細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控信號(hào)不能到達(dá)腫瘤組織，機(jī)體失去對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的控制，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的自主性生長(zhǎng)，提示間隙連接蛋白可能與多種致瘤因素共同參與了移行細(xì)胞癌的發(fā)生。國(guó)外學(xué)者通過(guò)反義核酸技術(shù)等阻斷細(xì)胞Cx的表達(dá)和GJIC功能，結(jié)果導(dǎo)致這些細(xì)胞失去生長(zhǎng)的控制，易形成腫瘤。這說(shuō)明Cx表達(dá)的異常很可能是腫瘤 (包括BTCC)多步驟癌變過(guò)程中的重要分子機(jī)制之一［7－8］。本研究結(jié)果顯示，Cx43 mRNA的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系表明Cx43的表達(dá)與BTCC的病理分級(jí)有關(guān)，與患者的腫瘤分期和腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)等無(wú)關(guān)。因此Cx43 mRNA的表達(dá)水平可作為BTCC分化程度和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的診斷指標(biāo)。

Bcl－2和Bax是Bcl－2家族中調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡中重要的一對(duì)基因，在多種上皮腫瘤中都有異常表達(dá)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Bcl－2蛋白異常表達(dá)與包括膀胱癌在內(nèi)的人類(lèi)多種惡性腫瘤的關(guān)系密切［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl－2 mRNA在BTCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常膀胱組織及癌旁組織，并隨BTCC病理分級(jí)的增高而增高，而且復(fù)發(fā)BTCC組織中Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平高于初發(fā)BTCC。而B(niǎo)TCC關(guān)于Bax的表達(dá)，文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BaxmRNA的表達(dá)在正常膀胱組織中與在BTCC組織中的表達(dá)無(wú)差異，在腫瘤各期、不同病理分級(jí)BTCC中其表達(dá)亦無(wú)差異，即表達(dá)相對(duì)恒定。有學(xué)者報(bào)道，Bcl－2在移行上皮組織有表達(dá)，但遠(yuǎn)低于癌組織，而且與惡性程度呈正相關(guān);Bax在正常移行上皮組織與癌組織均有表達(dá)，與腫瘤分期及病理分級(jí)均無(wú)關(guān)。這種現(xiàn)象表明Bcl－2或Bcl－2/Bax比值可能在BTCC的惡性進(jìn)展起重要作用［10－11］。

研究發(fā)現(xiàn)有許多促癌物通過(guò)抑制Cx的途徑阻斷GJIC后，細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控信號(hào)傳遞失控，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)，而凋亡的誘導(dǎo)劑可以增強(qiáng)Cx表達(dá)和GJIC功能，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化，說(shuō)明GJIC功能異常與癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系［12］。Krutovskikh等［13］對(duì)鼠膀胱癌細(xì)胞株 BC31 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)上調(diào)，GJIC功能增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)，增加細(xì)胞間Ca2+流的傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，BTCC組織中Bcl－2 mRNA高表達(dá)，Cx43 mRNA為低表達(dá)，提示Cx43 mRNA的表達(dá)與Bcl－2蛋白的表達(dá)水平相反，Cx43基因可能與凋亡相關(guān)基因Bcl－2(或Bcl－2/Bax)在BTCC的發(fā)展中起拮抗作用，其表達(dá)水平與細(xì)胞的凋亡過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)BTCC組織Cx43 mRNA的表達(dá)及其與Bcl－2 mRNA/Bax mRNA表達(dá)的相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)下調(diào)與BTCC的發(fā)生、進(jìn)展及其惡性特征有關(guān)，并且其表達(dá)水平與細(xì)胞的凋亡過(guò)程有關(guān)。如果能夠通過(guò)藥物或基因誘導(dǎo)促進(jìn)Cx43的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞的GJIC功能，抑制腫瘤細(xì)胞，將為膀胱移行細(xì)胞癌的診治研究提供新的思路。

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