王理揚綜述,姚文秀審校

(四川省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科,成都 610041)

肺癌是目前發(fā)病和病死率最高的惡性腫瘤,其中75%～80%是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。隨著表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶信號通路與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展等相關(guān)研究的不斷深入,EGFR酪氨酸激酶成為NSCLC治療及研究的重要靶分子。EGFR的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKI)藥物,在NSCLC中治療中顯示出很好的抗腫瘤療效。2004年4～5月,美國的兩個研究小組分別在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》和《科學(xué)》上發(fā)文報道了EGFR基因突變和吉非替尼療效間的相關(guān)性[1-2],吸引了肺癌研究領(lǐng)域所有學(xué)者的眼球,很快EGFR基因研究熱遍全球。

1 NSCLC的EGFR基因突變種類

EGFR基因突變在NSCLC比較常見,突變均位于胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)結(jié)構(gòu)域,目前報道的EGFR基因突變共有數(shù)百個。突變集中在EGFR的18～21外顯子,其突變比例分別為 4.7%、44%、9.3% 和 45%,這些外顯子是編碼EGFR-TK結(jié)構(gòu)域的主要部位。

目前已確認(rèn)的常見的有意義的突變有如下幾個:19外顯子上的突變主要是缺失突變(E19del),包括單純的缺失突變或缺失突變合并錯義突變。19外顯子上的突變均位于K745附近,而K745是ATP結(jié)合的關(guān)鍵部位。缺失突變幾乎均引起酪氨酸激酶域中LREA 4個氨基酸殘基的缺失,這一序列在脊椎動物中高度保守。21外顯子上的突變均為錯義突變,多數(shù)突變?yōu)榘l(fā)生在858位的L突變?yōu)镽(L858R),此突變位點緊鄰激酶活化環(huán)(activation loop)中高度保守的DFG模體。在所有突變中以 21外顯子上的 L858R和 19外顯子的缺失突變(E19del),二者最常見,約占 EGFR突變的 90%,都與小分子TKI的敏感度相關(guān)。20外顯子790位的 T突變?yōu)?M(T790M),是導(dǎo)致腫瘤對吉非替尼和厄洛替尼繼發(fā)耐藥的原因。

2 NSCLC的EGFR基因突變的臨床特征

目前的研究表明EGFR突變與性別、種族、吸煙、病理類型有關(guān),突變在腺癌、女性、非吸煙者及東亞人中發(fā)生率高。

早期的研究發(fā)現(xiàn),在NSCLC中EGFR基因突變幾乎僅見于腺癌,其他病理類型少有突變病例出現(xiàn)[3-4]。近期的前瞻性的IPASS研究亦證實[5],突變在腺癌出現(xiàn)的概率高。腺癌的分化程度與EGFR基因突變率有一定的關(guān)系,分化較好的腺癌(包括高分化和中分化的腺癌)比分化差的腺癌有更高的突變率[6]。

在EGFR基因突變發(fā)現(xiàn)之前,已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn),和白種人相比,吉非替尼在中國和日本 NSCLC患者中有更好的療效[7-8]。在與吉非替尼療效相關(guān)的EGFR基因突變發(fā)現(xiàn)后,隨著來自中國大陸、中國臺灣、韓國和日本關(guān)于肺癌患者EGFR基因突變情況報道的增加,進(jìn)一步證實這種療效的差別與EGFR基因突變率的人種或地域的差異是一致的。目前得到大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可:作為最常見的 EGFR突變-外顯子 19缺失(E19del)和外顯子21L858R突變,見于近10%～15%的白種人NSCLC患者和30%～40%的亞洲患者。

EGFR基因突變主要發(fā)生在不吸煙患者。Pao等的研究中將吸煙總量少于100支定為不吸煙,在15例不吸煙肺癌患者中EGFR突變率為47%,而隨機(jī)選取的81例患者中的突變率僅5%[9]。此后的研究進(jìn)一步證實了此現(xiàn)象[6,10]。顯然,EGFR基因突變不是煙草中的致癌物所致,對其深入研究可能為預(yù)防此類肺癌提供新的方法。

關(guān)于性別是否是EGFR基因突變的影響因素有一定爭議。多個研究的單因素分析中女性肺癌患者的突變率較高。由于女性患者多不吸煙,且腺癌的比例較高,是否是獨立影響因素,有研究者持不同意見。Kosaka等[6]采用 logistic回歸分析了性別、吸煙狀況、病理類型這3種因素對突變率的影響,結(jié)果僅吸煙狀態(tài)和腺癌是突變的獨立影響因素,突變率與性別無關(guān)。來自Miller等[11]的報道同樣發(fā)現(xiàn)139例吉非替尼治療的患者中男性和女性的療效無差別。

臨床流行病學(xué)特征的研究主要目的是尋找到對EGFRTKI有較好療效的人群,從療效與特定人群的關(guān)系中探尋EGFR-TKI治療肺癌的分子機(jī)制。在明確了EGFR突變與小分子TKI的關(guān)系后,臨床特征多用于無法取得病理標(biāo)本患者的療效預(yù)估,選擇合適的人群則EGFR的突變率相對較高,可作為是否存在突變的輔助參考依據(jù)。

3 NSCLC的EGFR基因突變的臨床意義

3.1 EGFR-TK基因突變與小分子TKI治療NSCLC療效的關(guān)系 雖然EGFR基因突變發(fā)生率在亞洲及歐美NSCLC患者之間有明顯差異,但 EGFR基因突變與小分子 TKI治療NSCLC有密切相關(guān)已得以公認(rèn)。EGFR突變 E19del和L858R的預(yù)測作用已經(jīng)明確。攜帶這些突變基因的患者對厄洛替尼或吉非替尼的反應(yīng)明顯較佳。初期回顧性研究顯示,使用厄洛替尼或吉非替尼后腫瘤緩解的患者大約90%攜帶突變,而未緩解者則無突變[1-2]。隨后的回顧性研究已證明,攜帶EGFR突變的細(xì)支氣管肺泡腺癌患者,接受單藥治療后客觀緩解率近80%,中位無進(jìn)展生存期為13個月[12]。

近年來多個前瞻性研究充分證實了EGFR突變對EGFRTKI的療效預(yù)測作用,EGFR突變患者無論是用厄洛替尼還是吉非替尼治療,有效率都比較高(55%～73%),無進(jìn)展生存1年左右,中位生存期也比較長[5,13-15]。近期一份 Meta分析顯示,所有人群中,EGFR突變預(yù)測TKI單藥的特異性和敏感性分別為78%和86%,東亞人群中預(yù)測的特異性和敏感性均為81%,西方白種人群分別為77%和91%[16]?？梢?在東方人和西方人群中,EGFR突變對TKI療效的預(yù)測價值是一樣的。

目前,較多研究者認(rèn)可EGFR突變是吉非替尼和厄洛替尼治療晚期 NSCLC的療效預(yù)測因子,推薦對初治的晚期NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變的檢測,并根據(jù)檢測結(jié)果決定患者的治療策略。而對于早期和局部晚期的NSCLC,目前的證據(jù)尚不能確定EGFR突變是否可以作為吉非替尼或厄洛替尼的療效預(yù)測因子。

3.2 EGFR基因突變與對 TKI耐藥的關(guān)系 盡管存在EGFR-TK突變的NSCLC患者對小分子 TKI反應(yīng)良好,但最終都出現(xiàn)了耐藥。目前認(rèn)為這類患者出現(xiàn)耐藥很大程度與出現(xiàn)了EGFR基因二次突變有關(guān)。20外顯子的T790M突變出現(xiàn)在大約50%的EGFR-TKI獲得性耐藥患者中[17-19]。

臨床前研究也支持上述臨床發(fā)現(xiàn),提示T790M突變是潛在的耐藥機(jī)制。轉(zhuǎn)染T790M到對吉非替尼敏感的肺癌細(xì)胞也出現(xiàn)了對吉非替尼耐藥[20]。目前還不清楚T790M突變導(dǎo)致耐藥的機(jī)制。一種解釋是,耐藥的原因是突變導(dǎo)致EGFR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使TKI與其結(jié)合出現(xiàn)位阻效應(yīng)[17,21-23]。另一種解釋是T790M增加了酪氨酸激酶對ATP的親和力,從而減小了ATP競爭性藥物的作用[24]。

目前已知除了T790突變外,尚有多種機(jī)制影響獲得性耐藥。如EGFR旁路TK信號通路異常(c-M et擴(kuò)增),EGFR下游信號分子變異導(dǎo)致PTEN失活等均與獲得性耐藥相關(guān)。

4 NSCLC的EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域基因突變的檢測方法

EGFR基因突變檢測對于臨床醫(yī)生進(jìn)行肺癌的個體化治療具有重要的參考價值。關(guān)于EGFR基因突變檢測的方法,目前仍然沒有一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法用于臨床,但多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)是進(jìn)行核酸擴(kuò)增和基因檢測的基礎(chǔ)方法,目前幾乎所有基因突變檢測的細(xì)胞和分子診斷技術(shù)都是建立在PCR基礎(chǔ)之上的。

4.1 直接測序法 目前,直接測序法仍然是檢測EGFR基因突變使用最多的方法,對突變的檢測相對準(zhǔn)確、完美,是確定堿基的種類和位置的最終檢測法。在一項有3101例患者的系統(tǒng)分析中,直接測序法預(yù)測EGFR-TKI單藥治療EGFR突變患者的療效的敏感性為78%,特異性高達(dá)88%[16]。但需要獲取腫瘤組織、分離腫瘤細(xì)胞、提取核酸和進(jìn)行測序,所需時間長,而且對取材和技術(shù)要求都比較嚴(yán)格。因此應(yīng)用于臨床仍受到一定程度的限制。

4.2 特異性位點的多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) EGFR基因突變模式相當(dāng)復(fù)雜,外顯子19的堿基缺失和外顯子21的錯義突變是兩種最主要的突變類型,占了突變類型的90%以上,因此被視為突變的兩個“熱點”。Ohnishi等[25]采用特異性突變的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mutation-specific PCR)、Asano等[26]采用突變體富集PCR法(mutant-enriched PCR)、Nagai等[27]采用核酸肽鎖核酸(peptide nucleic acid-locked nucleic acid,PNA-LNA)等各自不同的方法,檢測EGFR基因的兩個突變“熱點”。IPASS研究[5]采用的是突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)。上述幾種特異性位點的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對EGFR基因特異性突變的檢測盡管不需要測序,但必須借助凝膠電泳技術(shù)對PCR產(chǎn)物的性質(zhì)做出判斷,也只能針對已知的突變位點設(shè)計特異引物進(jìn)行檢測。

4.3 熒光實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 熒光實時PCR是近幾年迅速發(fā)展起來的一種新技術(shù),它完全脫離了凝膠電泳技術(shù),避免了有毒操作,且操作更加簡便、靈敏度更高。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物,主要包括雙標(biāo)記探針法、分子信標(biāo)法、DNA雙鏈非特異性內(nèi)嵌染料法。應(yīng)用熒光實時PCR檢測EGFR基因突變,并不需要檢測突變的基因組DNA的具體含量,僅需要檢測樣本是否具有擴(kuò)增信號即可,這就使得整個檢測過程更加簡單。

4.4 高效液相色譜法 高效液相色譜的基本原理是利用不同物質(zhì)在流動相和固定相中分配系數(shù)差異而得到分離。在高效液相色譜基礎(chǔ)上引入 temperature-modulated heteroduplex analysis(TMHA)概念即為變性高效液相色譜法。Bai等[28]用變性高效液相色譜法對晚期NSCLC患者配對癌組織和血漿中的EGFR突變情況進(jìn)行了研究。

4.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)是一種比較經(jīng)典的基因突變檢測的方法。用PCR-SSCP法檢測小于200 bp的PCR產(chǎn)物時,突變檢出率可達(dá)70%～95%,而片段大于400 bp時檢出率僅為50%左右,該法可能會存在1%的假陽性率。該法可以對未知的突變進(jìn)行檢測,較DNA測序法有更高的靈敏度。然而,PCR-SSCP需要平行的標(biāo)準(zhǔn)對照,受實驗條件影響較大,同時也只能做定性的判斷,對于突變機(jī)制的研究受益不大。

4.6 其他方法 其他常見的方法還有:毛細(xì)管電泳、限制性片段長度多態(tài)性、堿基切割序列掃描、DNA芯片法。

縱觀以上所有方法,相對于直接測序,其他分子生物學(xué)方法盡管靈敏度和/或特異性有所提高,但只能針對EGFR基因一些已知的常見的突變進(jìn)行,不能去檢測罕見或未知的突變(除外PCR-SSCP)。同時,大多數(shù)方法仍對組織的取材要求較高。此外,有的方法,需要特殊的儀器設(shè)備,因而仍然不能在臨床上進(jìn)行大范圍推廣。由于目前 PCR試劑尚未被正式批準(zhǔn),有些檢測方法還需要特殊儀器設(shè)備,推薦直接測序法作為目前EGFR突變檢測的常用方法。

綜上所述,NSCLC組織存在EGFR基因突變預(yù)示了其對EGFR-TKI的敏感性。對患者的個體化治療是優(yōu)化肺癌分子治療的核心,而對患者的EGFR基因檢測是選擇合理化治療的關(guān)鍵。隨著研究的深入,EGFR基因突變的檢測方法可能會更簡便、標(biāo)準(zhǔn),TKI治療的目標(biāo)人群可能進(jìn)一步明確,TKI的耐藥機(jī)制亦可能了解。未來還可能是采用多基因檢測,將系列基因檢測的結(jié)果很好地指導(dǎo)臨床,為肺癌個體化治療服務(wù),為肺癌患者造福。

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