湯麗霞,歐麗群,曾勁偉,梁彩紅,禤潔甜,林 蔚,陳華錦,楊 光

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院臨床研究所 528000)

人類血紅蛋白由兩對(duì)珠蛋白鏈構(gòu)成。在個(gè)體發(fā)育不同階段,胚胎階段、胎兒階段和成人階段,不同的α和β珠蛋白基因簇的開(kāi)放與關(guān)閉控制著人體珠蛋白表型的變化。成人階段主要表達(dá)血紅蛋白A(HbA)和少量的血紅蛋白A2(HbA2)。而胎兒階段以胎兒血紅蛋白(HbF)表達(dá)為主,HbA僅有少量。血紅蛋白在人體發(fā)育各階段都有正常參考值,抗堿法新生兒的HbF的正常參考值為55%～85%[1],但未見(jiàn)相應(yīng)高效液相色譜法(HPLC)和抗堿法在妊娠中晚期檢測(cè)胎兒臍帶血HbF濃度的正常參考值。本文使用HPLC和抗堿法檢測(cè)產(chǎn)前診斷中晚期妊娠胎兒臍帶血HbF濃度,計(jì)算相應(yīng)正常參考值范圍,并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷抽取臍血過(guò)程中母血污染臍血的篩查。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2006年7月至2007年12月在本院進(jìn)行中晚期妊娠產(chǎn)前診斷的孕婦抽取臍帶血共116例,男性胎兒56例,女性胎兒60例。2008年1月至2010年 6月使用 HPLC檢測(cè)臍帶血 HbF相對(duì)含量220例,男性胎兒 119例,女性胎兒101例。

1.2 染色體核型分析 肝素鈉抗凝管臍帶血0.3 mL加入拜迪生產(chǎn)的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基5 mL內(nèi),37℃培養(yǎng)70 h,加入秋水仙素終濃度0.04～0.08 μ g/mL繼續(xù)培養(yǎng) 2 h,常規(guī)低滲、固定、制片、G顯帶程序操作,計(jì)數(shù) 20個(gè)核型,LEICA CD4000系統(tǒng)分析大于等于5個(gè)核型。

1.3 抗堿法HbF定量檢測(cè) 方法見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。

1.4 HbF定量檢測(cè) HPLC采用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的Hb自動(dòng)分析儀-VARIANTTMⅡ(β-thalassemia Short Program)及廠家提供的配套試劑。每次進(jìn)行 HPLC分析時(shí)先測(cè)定廠家配套的高低兩個(gè)濃度的質(zhì)控品,室內(nèi)質(zhì)控合格才進(jìn)行研究對(duì)象標(biāo)本HbF的分析測(cè)定。每例標(biāo)本(或質(zhì)控品)取5 μ L,用1 mL的超純水稀釋,顛倒7～8次混勻后放置在專用試管架上自動(dòng)分析測(cè)定,6～7 min后顯示定量測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 抗堿法測(cè)定HbF 中期妊娠臍帶血標(biāo)本116例中,男56例,女60例。女性標(biāo)本中有2例HbF在3.0%以下,作為異常值排除,男性 HbF均值72.3%,s=13.8,女性 HbF均值72.2%,s=15.4,男女整體 HbF均數(shù)72.3%,s=14.8。秩和檢驗(yàn)?zāi)信詣e之間均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HPLC測(cè)定HbF 中晚期妊娠臍帶血標(biāo)本220例中,男119例,女101例。去掉 5例極端值,其中 4例 HbF＞100%(女1例,男3例),1例 HbF≤35%(女性)。215例中,臍帶血HbF均值 94.5%,S=5.6。其中男性胎兒 HbF均值為95.2%,s=4.5;女性胎兒 HbF均值為93.7%,s=8.8。秩和檢驗(yàn)?zāi)信詣e之間均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 染色體核型分析結(jié)果 在抗堿法檢測(cè)的114例胎兒中,染色體數(shù)目異常5例,染色體結(jié)構(gòu)異常 4例,染色體多態(tài)6例,共計(jì)15例。HPLC法檢測(cè)的215例胎兒中,數(shù)目異常12例,結(jié)構(gòu)異常3例,9號(hào)倒位8例,其他染色體多態(tài) 3例,共 26例。染色體多態(tài)和數(shù)目結(jié)構(gòu)異常占整體的12.5%。

2.4 抗堿法檢測(cè)HbF 單側(cè)下限99%可信區(qū)間HbF正常參考值:百分位數(shù)法求得,整體單側(cè)下限P0.5=48.7%,女性胎兒P0.5=48.8%,男性胎兒 P0.5=51.7%。

2.5 HPLC法檢測(cè)HbF 單側(cè)下限99%可信區(qū)間參考值:整體為P0.5=79.4%,男性胎兒 P0.5=83.5%,女性胎兒P0.5=76.2%。

3 討 論

人類α和β珠蛋白基因簇按照其在染色體上的排列順序由5′端向 3′端基因順序表達(dá)和關(guān)閉,形成了個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期6種珠蛋白表達(dá)種類的變化。6種人類的珠蛋白分別為:HbGower1(ζ 2ε 2)、HbGower2(α 2ε 2)、Hb potland(ζ 2γ 2)、HbF(α 2γ 2)、HbA(α 2β2)、HbA2(α 2δ 2)。HbGower1 和 HbGower2在妊娠早期合成,妊娠中晚期主要為HbF,妊娠晚期出現(xiàn)少量HbA和HbA2。正常情況下出生后3～4個(gè)月完成成人型血紅蛋白肽鏈轉(zhuǎn)變,HbA達(dá)95%以上,少量HbA2[2]。不同血紅蛋白的攜氧和釋氧能力不同,不同類型血紅蛋白相互更替對(duì)維持正常機(jī)體的生理功能具有重要意義。成人階段胎兒血紅蛋白F的升高出現(xiàn)在貧血、珠蛋白生成障礙性貧血、白血病或遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥等疾病[3-4]。本文探討妊娠中晚期胎兒階段HbF的下限,目的在于對(duì)產(chǎn)前診斷胎兒標(biāo)本抽取過(guò)程母血誤抽污染胎血的篩查判斷。

使用抗堿法和HPLC方法檢測(cè)336例產(chǎn)前診斷臍血HbF相對(duì)濃度,共3例女性胎兒HbF異常低下,其中1例母血污染的女胎臍帶血HbF相對(duì)濃度為35%,2例女胎臍帶血HbF濃度小于3%。后者屬于在臍帶血抽取技術(shù)開(kāi)展的初期發(fā)生的誤抽,其相應(yīng)的HbF濃度值在計(jì)算99%可信區(qū)間單側(cè)下限界值過(guò)程中被作為極端值去除?？箟A法和HPLC法檢測(cè)HbF的數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)非正態(tài)分布,進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后乃呈非正態(tài)分布。因此均采用百分位數(shù)法確定99%可信區(qū)間單側(cè)下限正常參考值。

抗堿法是廣泛使用的檢測(cè)胎兒血紅蛋白的方法?？箟A法檢測(cè)HbF濃度健康成人為1.0%～3.8%,新生兒為55%～85%[1,5-6],使用抗堿法檢測(cè)114例中晚期妊娠胎兒臍帶血的HbF,計(jì)算抗堿法HbF單側(cè)下限99%可信區(qū)間正常參考值為48.7%?？箟A法的下限界值估計(jì)結(jié)果受兩側(cè)尾部數(shù)據(jù)的影響較大,尤其是百分范圍大于95%,樣本含量不夠大時(shí),結(jié)果不夠穩(wěn)定。

HPLC方法檢測(cè)HbF是繼抗堿法之后更敏感、特異和準(zhǔn)確的方法[7-10],在珠蛋白生成障礙性貧血的篩查和診斷中已廣泛使用。采用HPLC方法檢測(cè)215例妊娠中晚期產(chǎn)前診斷的臍帶血HbF,用百分位數(shù)法確定99%可信區(qū)間單側(cè)下限正常參考值HbF為79.4%。HPLC法檢測(cè)HbF單側(cè)下限99%可信區(qū)間參考值較抗堿法提高了約30%,從兩種方法的統(tǒng)計(jì)描述中可以發(fā)現(xiàn)HPLC檢測(cè)HbF的數(shù)據(jù)離散度較抗堿法也明顯集中,均有利于母血污染臍帶血的判斷。

隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的普及應(yīng)用,臨床上越來(lái)越多高危孕婦需要進(jìn)行臍帶血染色體核型分析[11-15]。作為產(chǎn)前診斷的一部分,染色體分析報(bào)告發(fā)出之前必須對(duì)臍帶血的來(lái)源進(jìn)行確證。胎兒臍帶血與母體血液如果發(fā)生混合,可引起染色體分析結(jié)果的誤判。在臍帶血抽取的過(guò)程中,如果發(fā)生母血的污染或者誤抽母血的情況,則臍血中HbF的相對(duì)濃度遭遇母體血的稀釋,表現(xiàn)出HbF濃度降低。對(duì)于HbF濃度明顯小于79.4%單側(cè)下限界值的,高度懷疑為母血污染或誤抽,有必要進(jìn)一步采用親子鑒定的方法予以確證。

HPLC方法提高了HbF的正常參考值下限,并且縮小了檢測(cè)數(shù)據(jù)的離散度,在臍帶血染色體核型分析中,是一種經(jīng)濟(jì)有效的篩查母血污染臍帶血的方法。

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