周寶尚 綜述,張 璟審校

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院腎內科/全軍腎臟病中心/重慶市腎病研究所,重慶 400037)

腎小管間質纖維化是各種不同病因的慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同通路,是導致終末期腎病的主要病理基礎。近年研究顯示,腎小管上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腎小管間質纖維化的重要機制之一[1],腎小管上皮細胞可通過EMT轉分化為肌成纖維細胞(myofibroblast,MF),進入間質,合成細胞外基質(extracellularmatrix,ECM),直接導致腎間質纖維化的進行性發(fā)展。腎小管上皮轉分化受多種因素影響,TGF-β1被公認為是最重要的誘導上皮細胞轉分化的細胞因子。TGF-β1作為核心因子,啟動并調節(jié)EMT的全過程,其誘導EMT的過程也是在病理狀態(tài)下導致腎間質纖維化的主要途徑[2]。除此之外,整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK),受體酪氨酸激酶-Ras/絲裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK),RhoA/ROCK等均參與腎小管上皮細胞的轉分化過程。Wnt信號轉導通路在調控細胞的黏附、遷移、上皮間質轉化、生長、分化、凋亡等過程,以及在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和維持組織器官內環(huán)境穩(wěn)定中具有重要作用[3]。研究表明Wnt信號通路與腎纖維化的形成密切相關,近年來的研究證實Wnt信號轉導通路在腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]。因此深入研究Wnt信號轉導通路及其在腎間質纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用,可為抗腎臟纖維化的治療提供新的可能途徑及干預靶點。

1 Wnt信號通路

1982年,Nusse和Varmus[5]在用小鼠乳頭瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)誘導小鼠乳腺癌過程中發(fā)現(xiàn)了Wnt基因,由于該基因的激活依賴MM TV的插入(insertion),因此被命名為Int21。隨后的研究證明,Int21與果蠅屬體節(jié)極性基因Wingless為同源基因,因此,又將Wingless與Int21結合,稱為Wnt基因。

1.1 Wnt信號通路的組成 Wnt信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路,調控著機體的許多生命過程。該通路的主要成分包括Wnt蛋白家族、Frizzled/低密度脂蛋白受體相關蛋白(Fz/LRP)、胞質內的 Dishevelled蛋白(Dsh)、β-環(huán)連蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、支架蛋白(axin/conductin)、結腸腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)和 T細胞因子/淋巴增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)轉錄因子家族。Wnt是一種富含半胱氨酸殘基的分泌型糖蛋白,在進化過程中高度保守,在多種組織細胞中均有表達,主要通過自分泌或旁分泌的方式激活膜受體而發(fā)揮作用,Wnt蛋白表達是Wnt信號通路活化的重要起始信號。目前已知的主要有19種Wnt蛋白,參與 Wnt經典信號通路的Wnt蛋白有Wnt1,3a,8等。參與非經典信號通路的Wnt蛋白有Wnt4,5a,11等[6]。Fz為 7次跨膜蛋白,其氨基端的配體結合區(qū)(cysteine rich domain,CRD)富含半胱氨酸,是Wnt信號通路中最主要的受體蛋白。Dsh蛋白是Wnt經典信號從膜受體傳遞至胞內的中心分子,有3個高度保守的結構域(DIX、DEP、PDZ),Dsh能通過它的DIX結構域和PDZ與DEP結構域之間的一部分序列與axin相互作用。β-catenin是由CTNNB1基因編碼的一種多功能蛋白質,具有介導細胞間黏附及信號轉導兩大功能,1980年由德國細胞生物學家Walt Birchmeier在研究細胞黏附分子E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相關分子時首先發(fā)現(xiàn)的,是Wnt信號通路中有轉錄調控活性的關鍵成員,在細胞核內與Wnt途徑的另一成員TCF/LEF結合從而激活靶基因的轉錄[7]。

1.2 Wnt信號通路的轉導過程 目前的研究證實Wnt信號轉導通路分為:Wnt經典信號轉導通路,也稱 Wnt/β-catenin信號轉導通路和Wnt非經典信號轉導通路。Wnt/β-catenin信號轉導通路是目前研究比較多、比較深入的一條分支。

當經典的Wnt信號轉導通路被激活后,分泌到胞外的Wnt與跨膜受體Lrp5/Lrp6以及Fz結合形成復合物并激活受體,進而激活胞內的Dsh,導致GSK-3β活性受到抑制使其從axin上脫落,阻止β-catenin降解復合體(主要由 APC、axin、GSK-3β構成)的形成,因此β-catenin也就不會被磷酸化和降解[8]。研究同時發(fā)現(xiàn)β-catenin降解復合體(如 APC或 axin突變)和β-catenin基因本身突變均可導致β-catenin降解障礙。當胞內β-catenin達到一定的水平時,形成游離的β-catenin發(fā)生核轉移,與轉錄因子TCF/LEF結合,形成轉錄激活復合體,最終實現(xiàn)某些特定基因表達的增強或者減弱。現(xiàn)有的研究證明[9]該信號通路可以激活 c2myc、周期素D1(cyclin2D1)、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生長因子等,并且不斷有新的靶基因被發(fā)現(xiàn)。在這條信號途徑中β-catenin處于中心位置,其在細胞內的數(shù)量和狀態(tài)對該途徑有決定性影響,因此被認為是該信號途徑激活的標志[10]。

Wnt非經典信號轉導通路又分為Wnt/Ca2+通路和細胞極性通路(planar cell polarity pathway,PCP)。Wnt/Ca2+通路主要由Wnt5a和Wnt11激活,從而引起細胞內Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活,以調節(jié)細胞黏著和細胞運動,但其具體的信號傳導機制還不清楚。細胞極性通路PCP,其主要通過激活 Dsh下游區(qū)、小 GTP酶、Rho、Rac、Cdc等從而調節(jié)JNK信號來發(fā)揮作用[11]。該通路主要參與細胞極性的建立和細胞骨架重排。

2 Wnt信號通路與腎臟纖維化

2.1 Wnt信號通路相關蛋白在腎臟纖維化中的表達 正常機體腎臟中Wnt信號是“沉默”的[12],胞質中僅有少量游離態(tài)的β-catenin,體內絕大多數(shù)β-catenin在胞膜處與 E-cadherin形成復合體,對維持同型細胞的黏附、防止細胞的遷移發(fā)揮作用。Surendran等[3]利用單側輸尿管結扎方法造成大鼠小管間質性腎纖維化模型,發(fā)現(xiàn)Wnt4在集合管中有表達伴隨集合管周圍纖維化形成,間質成纖維細胞Wnt4高水平表達與I型膠原mRNA及α-SMA的高表達一致;體外實驗表明Wnt4可以誘導培養(yǎng)的成纖維細胞β-catenin進入細胞核內。Surendran等進一步研究發(fā)現(xiàn)腎損傷后腎小管上皮細胞及間質細胞中βcatenin信號活化,重組的sFRP4蛋白可以抑制成纖維細胞的分化及其功能,從而抑制腎纖維化的進程。Bienz[10]在單側輸尿管結扎大鼠腎臟纖維化模型中發(fā)現(xiàn)多種Wnt信號通路及靶基因蛋白Wnt(1,2,2b,3,3a,4,5a,6,7a,7b,8a,9a,16)、FZD(3,10)、 DKK(1,3,4)、Twist、β-catenin、c-Myc、LEF、fibronectin、MMP-7均不同程度的升高。Lin等[13]研究表明在高糖條件下腎小球膜細胞 Wnt4、Wnt5a、p-GSK-3β、β-catenin 高表達。閆喆等[14]利用高糖培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞,檢測發(fā)現(xiàn)Wnt4、β-catenin和α-SMA的mRNA和蛋白表達水平均增高,而E-cadherin表達降低,且Wnt4及胞核β-catenin蛋白表達與高糖刺激呈時間依賴性。這些說明當腎臟纖維化時,Wnt信號轉導通路相關蛋白表達增加,提示Wnt信號轉導通路可能在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。

2.2 Wnt信號通路在腎臟纖維化中的轉導 當Wnt通路被激活后,Wnt蛋白與細胞膜上的跨膜受體結合,激活胞漿內的散亂蛋白,使β-catenin的降解復合體:Axin/APC/GSK-3β復合物解聚而失活,β-catenin磷酸化受抑制而降解減少,進入細胞核內的β-catenin大大增加,與轉錄因子 T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)家族成員結合,形成轉錄激活復合體,引起特定的基因增強或減弱,最終促進EMT的發(fā)生,目前證實有Twist、E-cadherin、fibronectin、MM P-7、α-SMA 等重要的與纖維化相關基因[4,15]。同時,Wnt信號通路與 TGF-β1通路、PI3K/Akt通路和ILK之間有著重要的對話。TGF-β1促進Wnt蛋白的分泌,激活 PI3K/Akt通路和 ILK,直接磷酸化GSK-3β并抑制其活性,進而激活轉錄復合體β-catenin/TCF以及轉錄因子,促進 EMT[16]。此外,TGF-β1與受體結合,活化的TGF-β1受體能夠特異地識別和磷酸化 Smad蛋白家庭成員Smad2和Smad3,R-Smads又與其伴侶分子Smad4結合,形成有功能的轉錄復合體,Smad3、Smad4可以與β-catenin和TCF/LEF結合,促進兩信號間相互作用,引起靶基因的轉錄[17-18]。

3 以Wnt信號通路為靶點的抗纖維化治療

越來越多的研究表明,Wnt/β-catenin信號轉導通路與腎臟纖維化密切相關,因Wnt信號途徑最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤的發(fā)生,針對Wnt/β-catenin信號轉導通路中信號分子為靶點的抑制劑已成為抗腫瘤的候選藥物,而這些同樣可能成為于抗腎臟纖維化的治療靶點,只是目前仍在研究階段。

3.1 在細胞外水平阻斷Wnt信號 Wnt配體本身可通過反義寡核苷酸技術、RNA干擾技術及中和抗體技術等成為抗腎臟纖維化治療靶點。Wnt信號分子的拮抗劑,如Wnt信號分子特異性結合的卷曲相關蛋白(frizzled-related proteins,FRPs)和DKKs,已成為天然的抗腫瘤藥物。DKK蛋白是Wnt輔助受體LRP5/6的拮抗劑,具有抗腎臟纖維化潛能,在人類中已發(fā)現(xiàn)4種DKK蛋白。Zhu等[19]利用培養(yǎng)的間充質干細胞釋放的DKK1可明顯降低腫瘤細胞的侵襲和運動能力,并可誘導β-catenin的定位改變及增加細胞間黏附。Dai等[20]研究發(fā)現(xiàn)DKK1可以明顯抑制阿霉素處理大鼠的Wnt/β-catenin信號轉導通路,改善蛋白尿及腎臟纖維化。He等[4]研究發(fā)現(xiàn)DKK1可以顯著的抑制單側輸尿管結扎大鼠腎臟β-catenin的堆積,從而抑制α-SMA以及膠原的產生。

3.2 在細胞質水平靶向 Wnt/β-catenin信號 Wnt/β-catenin信號轉導通路通過細胞內蛋白-蛋白的相互作用而受到嚴密調控。由于結腸腺瘤性息肉病基因蛋白APC在結直腸癌中的核心作用,使針對該蛋白的β-catenin結合區(qū)域的阻斷劑成為有效抑制腫瘤的物質。axin是Wnt/β-catenin信號轉導通路的負性調控者,該基因突變是某些腫瘤發(fā)生的重要因素。劉樹立等[21]將 axin基因轉染入axin低表達的肺癌BE1細胞系,結果axin的mRNA和蛋白水平均明顯增加,β-catenin蛋白表達明顯減少,TCF-4的蛋白和mRNA表達均明顯下降。同時,BE1-axin細胞的凋亡率增加,增殖和侵襲能力明顯下降。因此,在胞質水平加強APC、axin等的表達,可以達到對過剩β-catenin的降解作用,從而阻斷下游信號轉導,達到抗纖維化的目的。

3.3 靶向β-catenin蛋白表達和降解 β-catenin是 Wnt信號通路的關鍵分子。以往研究表明,在纖維化的過程中都存在βcatenin表達水平上調,因此靶向β-catenin的治療引起人們的廣泛關注。目前,反義寡核苷酸技術、RNA干擾技術及蛋白敲除技術處于研究階段。特異性的β-catenin干擾RNA可以減少腫瘤β-catenin蛋白的表達,從而阻斷Wnt信號通路,成為不依賴GSK-3β磷酸化抗腫瘤治療的一個新靶點。Hong等[22]用β-catenin干擾RNA轉染人胃癌細胞,發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制β-catenin的表達、胞核分布以及胃癌細胞的生長。麥玉潔等[23]同樣用β-catenin干擾 RNA轉染白血病細胞Jurkat和K562細胞,結果β-catenin的mRNA和蛋白水平均降低,對細胞的生長有明顯的抑制。然而,目前其在抗腎臟纖維化方面的研究還有待進行進一步的研究。

3.4 在細胞核水平靶向 Wnt/β-catenin信號轉導通路 βcatenin最終發(fā)揮生物學效應是在其入核同TCF/LEF形成復合物,增強或抑制特定的靶基因實現(xiàn)的。因此,抑制復合物的形成理所當然地成為了抗纖維化治療的又一治療靶點。Lepourcelet等[24]設計出用于鑒別抑制 TCF-4與β-catenin相互作用化合物的高通量藥物篩選方法。Wei等[25]應用3種TCF-4與β-catenin復合物拮抗劑 PKF118-310、PKF115-584和 CGP 049090處理肝癌細胞,可以明顯地抑制c-Myc、cyclin D1和survivin等的轉錄活性,從而抑制癌細胞的生長。

4 結 語

綜上所述,Wnt信號轉導通路在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但目前對Wnt信號轉導通路本身及其在腎臟纖維化中的作用機制尚未完全闡明。Wnt信號轉導通路的調控方式、與其他信號通路間的相互作用、各靶基因激活的作用和意義、參與Wnt信號轉導通路的各分子的生理作用等均需進一步研究證實。隨著對這條信號轉導通路不斷深入的了解,有望把Wnt信號轉導通路作為抗腎臟纖維化治療的一個重要靶點。

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