周珍輝，陳萬榮，周育森，向雙云，曹金元，李玉冰，楊久仙，曹授俊 ，田璐，張浩

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，北京 102442；2.中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071）

Ⅰ型鴨病毒性肝炎（serotypeⅠ duck viral hepatitis，DHV Ⅰ ）由Ⅰ型鴨肝炎病毒引起，以發(fā)病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征，臨床表現(xiàn)為痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，主要病變?yōu)楦闻K出血、壞死和腫脹，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一[1-4]。筆者對分離的DHV進(jìn)行純化，并制備單克隆抗體，旨在建立特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便快速的DHV檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

毒株由北京某鴨場分離，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)、鴨胚尿囊腔接種、PCR診斷，確診為Ⅰ型鴨肝炎病毒[5-6]。試驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子病原研究室提供；抗體亞類試劑盒購自Gibco公司；10日齡鴨胚及1日齡雛鴨購自北京三江宏利牧業(yè)有限公司。

1.2 抗原制備及鑒定

1.2.1 DHV抗原的純化

將臨床發(fā)病鴨的肝臟制成懸液，通過尿囊腔接種10日齡鴨胚，收集接種后4～5 d死亡的鴨胚尿囊液，反復(fù)凍融后，4 ℃ 6 000 r/min離心，去沉淀，取上清，加等量氯仿，振搖20 min，4 ℃ 6 000 r/min離心，去沉淀，取上清，重復(fù)上述過程6次，收集上清液。在收集的上清液中加入10% PEG6000及終濃度為0.4 mol/mL的NaCl，4 ℃磁力攪拌過夜后，4℃1 2 000 r/min離心，去上清，沉淀加少量pH7.4、0.01 mol/mL PBS重懸，再經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心純化[7]。設(shè)30%和60% 2個(gè)蔗糖梯度，于10 mL離心管中，每一梯度溶液加4 mL，最后在溶液面上加粗提抗原2 mL，經(jīng)35 000 r/min離心4 h，分別收集各明顯的梯度帶。純化抗原作適當(dāng)稀釋，磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)及純度。純化病毒作免疫原免疫動(dòng)物用和包被抗原檢測抗體用。純化抗原的蛋白質(zhì)量濃度為0.77 mg/mL，－80 ℃冰柜凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 正常尿囊液抗原的制備

在制備DHV尿囊液的同時(shí)，取正常14至15日齡鴨胚尿囊液，同步純化蛋白。除不進(jìn)行超速離心外，其余按1.2.1的方法進(jìn)行，檢測蛋白質(zhì)量濃度為1.94 mg/mL，作包被抗原間接ELISA法篩選抗體時(shí)排除非特異用，－80 ℃冰柜凍存，作為陰性抗原對照。

1.2.3 純化抗原的病原性鑒定

將提純抗原經(jīng)0.22 μm濾膜處理，接種10日齡鴨胚5枚，對照組鴨胚注射生理鹽水，每天照蛋2次，逐日統(tǒng)計(jì)鴨胚死亡情況；采取頸背部皮下注射的方式，注射1日齡雛鴨5只，對照組雛鴨注射生理鹽水，觀察雛鴨發(fā)病死亡情況。

1.3 免疫BALB/c小鼠

第1次免疫時(shí)取純化抗原與福氏完全佐劑等量混合，充分乳化后，按每只100 μg（每只0.5 mL）的抗原量，采取腹部皮下兩點(diǎn)注射的方式，注射8 周齡BALB/c 雌性小鼠3 只，另取1只小鼠注射生理鹽水為對照；2周后取純化抗原與福氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行第2次免疫，方法與第1次免疫相同；4周后進(jìn)行第3次免疫，方法與第1次免疫相同；6周后從免疫小鼠和對照小鼠的尾尖采血，分離血清，將純化的DHV抗原分別以2、5、10 μg/mL包被96孔板，同時(shí)用純化的正常尿囊液蛋白按上述濃度分別包板，用間接ELISA法檢測血清中的抗體含量。當(dāng)免疫小鼠抗體含量較高時(shí)，融合前加強(qiáng)一次免疫，直接用純化抗原經(jīng)腹部皮下分兩點(diǎn)注射免疫小鼠，第4天后取抗體含量最高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選抗體。

1.4 雜交瘤細(xì)胞株的融合和篩選

參照文獻(xiàn)[8-9]，取抗體含量最高免疫小鼠的脾細(xì)胞和處于對數(shù)生長期的SP2/0 細(xì)胞，按（1∶5）～（1∶10）的比例進(jìn)行融合，融合后分裝5塊96孔板，置37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中，用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，1周后改用HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長狀況，7～9 d用間接ELISA法 進(jìn)行檢測篩選。用純化抗原與純化正常尿囊液蛋白分別包被96孔板，蛋白濃度為10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃過夜，次日用PBS-Tween-20洗滌3次，每孔加入100 μL初篩抗體，37 ℃作用1 h，用同樣的方法洗板3次，加入酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃作用30 min，洗滌3次，加入顯色劑顯色后，再加終止液終止，用酶標(biāo)儀測定OD值。選擇經(jīng)純化抗原檢測后OD值較高且與正常純化尿囊液蛋白無反應(yīng)的陽性孔進(jìn)行亞克隆。用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行3次亞克隆后，上清檢測陽性率達(dá)100%的單克隆孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞株，制備腹水。

1.5 腹水的制備、效價(jià)檢測及特異性鑒定

1） 腹水的制備。參照文獻(xiàn)[8]，給每只BALB/c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟油0.5 mL，2 周后再注射雜交瘤細(xì)胞，每株單抗注射4只小鼠，每只0.5 mL，每1 mL含1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。2 周左右有腹水產(chǎn)生，抽取腹水，56 ℃滅活凍存，備用。

2） 腹水效價(jià)的測定。將純化抗原與純化正常尿囊液蛋白包板后，用間接ELISA法檢測腹水中的抗體效價(jià)。包被用抗原量為10 μg/mL，每孔100 μL。

3） 腹水的特異性鑒定。將腹水1∶100稀釋，分別用純化DHV抗原、正常純化尿囊液蛋白和乙型肝炎表面抗原（HBS）包板，用間接ELISA法檢測。

1.6 單克隆抗體亞類鑒定

用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測定8株單抗的類型。按說明書，用ELISA法進(jìn)行檢測。

1.7 鴨胚中和試驗(yàn)

采用固定病毒-稀釋抗體法[10]進(jìn)行EID50的測定：取經(jīng)尿囊腔繁殖的病毒液用PBS進(jìn)行10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6稀釋，每個(gè)稀釋度尿囊腔接種5枚10日齡鴨胚，7 d內(nèi)逐日觀察鴨胚的死亡情況，計(jì)算出200個(gè)TCID50的含量。將7株單抗所產(chǎn)生的腹水用濾膜過濾后，用PBS作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀釋，用含200個(gè)TCID50的DHV病毒液分別與7株單抗原液不同稀釋度的腹水等量混合，37 ℃作用2 h后，各稀釋度尿囊腔接種10日齡鴨胚5枚，0.2 mL/枚，另設(shè)5枚接種病毒，作為對照。逐日觀察9 d，記錄鴨胚死亡情況。

1.8 雛鴨保護(hù)試驗(yàn)

1日齡雛鴨分為8組，每組8只，前7組分別頸背部皮下接種DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12腹水0.5 mL，24 h后接種含毒尿囊液0.2 mL，第8組只接種含毒尿囊液0.2 mL，作為對照。各組鴨分開飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄各組鴨的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的純化及鑒定結(jié)果

病毒經(jīng)凍融氯仿反復(fù)處理及離心后，去除了大量的雜蛋白，經(jīng)PEG-6000 濃縮后，病毒蛋白含量大大提高。濃縮抗原經(jīng)蔗糖密度梯度離心，共出現(xiàn)了2個(gè)明顯條帶。約位于30%蔗糖梯度間的條帶為病毒帶。在電鏡下可見直徑20～40 nm的病毒粒子，呈球形或類球形，顆粒結(jié)構(gòu)清晰，大小、結(jié)構(gòu)均符合Ⅰ型DHV特征（圖1）。將純化抗原接種鴨胚后可導(dǎo)致鴨胚全部死亡，胚體出血明顯。攻毒1日齡雛鴨2～3 d后死亡，肝臟上有針尖到米粒大小的出血斑點(diǎn)。

圖1 鴨肝炎電鏡照片F(xiàn)ig.1 Electricity lens picture of DHV

DHV病毒的純化方法較多，在前期工作中用硫酸銨沉淀病毒后，發(fā)現(xiàn)雜蛋白多，病毒的形態(tài)被破壞，結(jié)構(gòu)模糊[11-12]。通過反復(fù)凍融，氯仿去脂，PEG沉淀，蔗糖密度梯度離心后，得到了較純的DHV，電鏡下可見大量DHV顆粒，通過鴨胚尿囊腔接種，感染鴨胚全部死亡，說明經(jīng)過上述純化后，抗原保持了良好的活性。

2.2 小鼠免疫結(jié)果

小鼠三免后采血，純化抗原包板后，檢測出3只免疫小鼠血清抗體的效價(jià)為（1∶400）～（1∶16 000），正常小鼠的效價(jià)＜（1∶100）。正常純化尿囊液蛋白包板后，用間接ELISA法檢測出3只免疫小鼠及正常小鼠血清抗體的效價(jià)均＜1∶100。由此，可以排除分泌針對正常尿囊液抗體的雜交瘤細(xì)胞株。10 μg/mL抗原用量包板后所測得的OD值優(yōu)于2、5 μg/mL的抗原用量，故在進(jìn)行單克隆抗體的篩選中，將包板的最佳抗原用量定為l0 μg/mL。

免疫小鼠血清抗體含量檢測結(jié)果顯示，用純化抗原包板檢測的OD值顯著高于用正常純化尿囊液蛋白包板所測得的OD值。由此可知，免疫小鼠血清中的抗體主要由注射DHV抗原所致，小鼠免疫效果好，免疫用的DHV抗原純度較高。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的融合和篩選結(jié)果

細(xì)胞融合經(jīng)過初次檢測，3次亞克隆后，共篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞8株，分別命名為DHV-1、 DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12。在亞克隆過程中，有DHV-2、DHV-3、DHV-4、DHV-5共4株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體特性丟失。DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11、DHV-12經(jīng)過多次傳代、凍存復(fù)蘇后，保持了穩(wěn)定分泌抗體的功能。在初次篩選時(shí)，選用OD值0.5以上的陽性孔進(jìn)行亞克隆，這樣可以更多地篩選出陽性的雜交瘤細(xì)胞株而不致于丟失。正常純化的尿囊液以10 μg/mL包板篩選單克隆抗體時(shí)，OD值均為0.01～0.10，因此，篩選陽性孔時(shí)基本排除了非特異性反應(yīng)。

2.4 腹水的效價(jià)及特異性鑒定結(jié)果

正常純化尿囊液蛋白包板后，用間接ELISA法檢測8株單抗腹水中的抗體效價(jià)均＜（1∶100）。將純化抗原包板后，用間接ELISA法檢測8株單抗腹水中的抗體效價(jià)，DHV-7、DHV-8為1∶1 000，DHV-6、DHV-10為1∶8 000，DHV-1、DHV-9、DHV-11和DHV-12為（1∶32 000）～（1∶512 000）。由此可知，腹水中的抗體主要是針對DHV抗原產(chǎn)生的。經(jīng)間接ELISA法鑒定，所制備的單克隆抗體與乙型肝炎表面抗原、正常純化尿囊液蛋白無交叉反應(yīng)，表明所制備的雜交瘤細(xì)胞具有良好的特異性。

2.5 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

經(jīng)MAb亞類鑒定，所獲得的雜交瘤細(xì)胞株DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-10為IgG1亞類，DHV-1、DHV-12為IgG2a亞類，DHV-2、DHV-9、DHV-11為IgG2b亞類，輕鏈均為k鏈。

2.6 鴨胚中和試驗(yàn)結(jié)果

接種病毒的鴨胚在接種后3～4 d全部死亡。DHV-6、DHV-7、DHV-9、DHV-10能原倍中和病毒，2倍稀釋后中和保護(hù)率為50%，各稀釋度均能明顯延緩鴨胚的死亡。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12原倍中和的保護(hù)率為50%，各稀釋度均能明顯延緩鴨胚的死亡。

2.7 雛鴨保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，DHV-6、DHV-7、 DHV-9、DHV-10單抗對雛鴨的保護(hù)率為50.0%～62.6%。DHV-1、DHV-8、DHV-11、DHV-12 4株單抗對雛鴨的保護(hù)率差，在25%以下。

3 結(jié)論與討論

正常鴨胚尿囊液中的混雜物很多，需對尿囊液中的病毒進(jìn)行純化。本研究中，在抗原純化、小鼠免疫、雜交瘤細(xì)胞株的融合篩選、腹水效價(jià)檢測試驗(yàn)中，均以正常尿囊液作對照，免疫用的DHV抗原純度較高，排除了非特異性反應(yīng)。在試驗(yàn)過程中，為防止細(xì)胞的突變返祖，確保骨髓瘤細(xì)胞對HAT的敏感性，每3～6個(gè)月應(yīng)用8-氮雜鳥嘌呤（8-AG）篩選1次。細(xì)胞融合后第1次克隆化的時(shí)間應(yīng)盡可能早，越早越不容易丟失陽性克隆。要盡早檢測，以確定細(xì)胞融合后的克隆是否分泌特異性抗體。一旦檢測為陽性，則不論其細(xì)胞克隆的大小，應(yīng)立即進(jìn)行克隆化，這是保證克隆化成功、獲得穩(wěn)定分泌McAb雜交瘤細(xì)胞系的非常重要的一環(huán)。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

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英文編輯：羅文翠