李薇，羅維，余興龍，李潤成，白霞，葛猛，王亞，向衛(wèi)軍，李晶

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）為小型、環(huán)狀雙義單鏈DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，PCV包括圓環(huán)病毒 1（PCV-1）和圓環(huán)病毒2（PCV-2）2種病毒，其中PCV-1對豬無致病力，而PCV-2與豬的多種疾病有關(guān)，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）和皮炎腎病綜合癥（PDNS）及PCV-2相關(guān)性豬呼吸道疾病綜合癥、繁殖障礙、增生性腸炎等，這些病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）。根據(jù)基因組的同源性分析，PCV-2可分成2個基因群，即1群（1 767 bp）和2群（1 768 bp）。1群PCV2又可分為1A、1B、1C共3個亞群（以上簡稱“三個亞群”）；2群PCV2又可分為2A、2B、2C、2D、2E共5個亞群[1-2]。2004年，加拿大東部地區(qū)豬群中 PCVD危害明顯加重，這與當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)了 1群PCV-2的毒株有關(guān)[2]，類似的情況也見于美國和歐洲[3]。Grau-Roma等[4]發(fā)現(xiàn)所有的1群PCV-2毒株全部來自發(fā)生PMWS的豬場，而從無PMWS的豬場中只能分離到2群PCV-2，也表明1群PCV-2比2群PCV-2致病性可能更強。Opriessnig等[5]發(fā)現(xiàn)不同PCV-2分離株間也存在毒力差異，這可能是感染PCV-2的豬不發(fā)病現(xiàn)象普遍存在的原因，提示應(yīng)從不同基因群內(nèi)各亞群上來研究毒株與毒力的關(guān)系。臨床上，同一豬體內(nèi)可以同時感染多種不同基因群或基因亞群的PCV-2毒株[1,4,6]，從而使研究毒株與毒力之間的關(guān)系變得更加復(fù)雜。筆者構(gòu)建了 1群PCV-2共3種基因亞群1A、1B和1C的感染性克隆，以便更好地研究1群PCV-2不同毒株與毒力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料和細(xì)胞及小鼠

含1B PCV-2的病料來源于湖南邵陽某豬場疑似PMWS樣品；含1A和1C PCV-2的病料從疑似PMWS病料在小鼠上傳代獲得；無PCV-1的PK-15細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈[7]；20 g左右的昆明小鼠購自湖南省疾病控制中心。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

Taqplus DNA聚合酶、Taq酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒分別購自天為時代生物有限公司；DL2000 DNA Marker、T4連接酶、限制酶SacⅡ、pMD-18T試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

MEM 培養(yǎng)基、新生犢牛血清、谷氨酰胺為GIBCO產(chǎn)品；羊抗鼠熒光二抗產(chǎn)品均購自 Sigma公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

借助DNAStar，將GenBank上已登錄的PCV-2基因組序列作同源性比較后，設(shè)計并合成PCV-2引物（表1），表1中Fp1及Rp1引物均包含基因組中491 nt處唯一的SacⅡ限制酶切序列，用下劃線標(biāo)示。

表1 PCV-2引物Table 1 Primers of PCV-2

1.2.2 3個亞群PCV-2全基因組的PCR擴增

適量含1A、1B、1C共3種亞群毒株的病料勻漿后，按蛋白酶K、酚、氯仿抽提方法提取基因組，用PCV-2基因組全長引物Fp1和Rp1擴增PCV-2全長基因組，PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，68℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物的克隆與鑒定

PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用PCR方法鑒定重組菌落，并將陽性菌落接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，菌液送英韋創(chuàng)津公司進行基因測序。

1.2.4 3個亞群PCV-2基因組轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞

用堿裂解法大量提取測序正確的陽性重組質(zhì)粒，用SacⅡ限制酶切出PCV-2全長基因序列，將此序列回收后再用T4連接酶16 ℃連接過夜，讓其自身連接，回收連接產(chǎn)物，并用核酸蛋白定量儀測定其核酸含量，連接產(chǎn)物分別命名為icRP8（1A）、icP0 （1B）、icP4-1 （1C）。待PK-15細(xì)胞生長至90%滿度，采用Invitrogen公司的Lipofectamine2000 將上述3種連接物分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程參照其產(chǎn)品說明書。

1.2.5 感染性克隆在 PK-15細(xì)胞上傳代及體外感染性的測定

轉(zhuǎn)染的1A、1B、1C亞群感染性克隆分別在PK-15細(xì)胞上盲傳至第5代，按常規(guī)法提取基因組后，用PCV-2全長引物Fp1和Rp1擴增PCV-2，并直接取PCR產(chǎn)物送英韋創(chuàng)津公司測序分析。用胰酶消化培養(yǎng)72 h第5代的細(xì)胞，滴加到帶圓孔鍍膜載玻片上的圓孔中，并在5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，待其貼壁，之后甩掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌，80%的冷丙酮4 ℃固定30 min，甩掉固定液，風(fēng)干干燥，后加1∶20稀釋的抗PCV-2的鼠高免血清[8]，37℃作用1 h，PBS泡洗后，再滴加0.01%伊文斯蘭1∶64倍稀釋的羊抗鼠熒光抗體，37 ℃作用1 h，PBS泡洗3次，干燥后滴加50%甘油磷酸緩沖液，置OLYMPUS BX51熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 PCV-2 感染性克隆體內(nèi)感染性的測定

取20 g左右的昆明小鼠，分4組，每組6只。第1組至第3組分別接種1A、1B、1C亞群感染性克隆的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物。第4組接種正常的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物。接種方式均為腹腔注射結(jié)合滴鼻。在接種后第5天分別尾靜脈取血，提取血液中的總DNA，用PCV-2檢測性引物檢測PCV-2，用PCV2 1A、1B、1C亞型的特異性引物進一步檢測3種亞型。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個亞群PCV-2全長基因組的克隆

由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，用 PCR方法，從病料中擴增出了預(yù)期大小的 1.8 kb左右的DNA片段。此片段與pMD-18T載體連接后，經(jīng)PCR鑒定后獲得的重組質(zhì)粒分別命名為RP8、P0和P4-1 （GenBank登錄號分別為 FJ716704、EU095020、FJ667588）。同源性分析表明，RP8代表的 PCV-2序列屬于PCV-2中的1A亞群序列，P0為PCV-2 1B亞群，P4-1為PCV-2 1C亞群序列。

2.2 3個亞群感染性克隆的構(gòu)建

1A、1B、1C亞群的重組質(zhì)粒用SacⅡ限制酶均能成功切出1 800 bp的PCV-2基因片段，構(gòu)建的感染性克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別連續(xù)盲傳 5次后，經(jīng)PCR檢測，用引物Fp1和Rp 1分別擴增出了1 800 bp的PCV-2目的片段。用間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染的第5代細(xì)胞（圖 1），可見熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，沒有PCV-2感染的細(xì)胞呈紅色。PCR結(jié)果和免疫熒光結(jié)果表明感染性克隆構(gòu)建成功，已經(jīng)產(chǎn)生出子代PCV-2。

圖1 3個亞群PCV-2感染性克隆免疫熒光結(jié)果（40×0.75）Fig.1 ⅠFA results of an infectious molecular clones of three subgroups of PCV-2 （40×0.75）

2.3 3個亞群感染性克隆的體內(nèi)感染性

將1A、1B、1C感染性克隆的細(xì)胞培養(yǎng)物分別接種3組小鼠后，用引物Fp2和Rp2進行 PCR擴增，分別能從3組小鼠中檢測到500 bp左右的PCV-2特異性片段，而對照組沒有。用PCV-2亞型特異引物擴增，接種PCV-2 RP8第1組老鼠只能用1A型引物擴增出140 bp左右的特異條帶，接種P0的第2組老鼠只能用1B型引物擴增出230 bp左右的特異條帶，接種P4-1的第3組老鼠只能用1C型引物擴增出560 bp左右的特異條帶（圖2），但是接種小鼠不表現(xiàn)任何臨床癥狀。PCR結(jié)果表明，構(gòu)建的1A、1B、1C亞群的感染性克隆，即RP8、P0和P4-1毒株在小鼠體內(nèi)都具有感染能力。

圖2 PCV-2的3個亞群特異性引物小鼠內(nèi)PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR amplication result of three subgroups of PCV-2 in mice using specific subgroup primers

3 結(jié)論與討論

將獲得的1A、1B、1C亞群毒株的基因組通過酶切自身連接環(huán)化的方法分別構(gòu)建成不同的感染性克隆，轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞并傳代，PCR與IFA檢測均證明構(gòu)建的1A、1B、1C感染性克隆在體外均具有感染性。為進一步研究1A、1B、1C感染性克隆在體外的感染性，分別將1A、1B、1C感染性克隆的細(xì)胞培養(yǎng)物接種小鼠，并采取滴鼻與腹腔注射結(jié)合的接種方式，以確保病毒能接到小鼠體內(nèi)。PCR檢測證明1A、1B、1C感染性克隆在小鼠體內(nèi)也具有感染性。

越來越多的資料支持1群PCV-2是毒力更強的毒株[3,4,9-12]的觀點。1群PCV-2的不同亞群間是否存在著毒力的差異，還有待研究。從病豬體內(nèi)分離的病毒，往往是多種PCV-2毒株的混合物，不利于弄清不同類型PCV-2與毒力的關(guān)系。2000年Fenaux等[13]首次報道利用感染性分子克隆接種SPF豬，并復(fù)制出 PCV-2典型的臨床癥狀和病理變化。Opriessnig等[1]構(gòu)建了 2個可引起感染豬不同臨床癥狀的PCV-2毒株的感染性克隆，因此，可構(gòu)建不同類型毒株的感染性克隆來研究其與毒力的關(guān)系。

從病料中克隆的3個PCV-2全基因經(jīng)測序分析，分別屬于PCV-2的1A、1B、1C亞群，其中1B亞群分離自湖南邵陽某豬場疑似PMWS豬淋巴組織，1A、1C亞群則是將該疑似PMWS豬病料接種小鼠并在小鼠體內(nèi)傳代獲得的，將在小鼠內(nèi)獲得的毒株序列與GenBank收錄的所有PCV-2序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)很多PCV-2序列與本試驗小鼠內(nèi)獲得序列的同源性在99%以上，表明在傳代小鼠體內(nèi)獲得的毒株也普遍存在于豬群中，后來經(jīng)檢測，在原始病料中即含有同樣的1A與1C亞型病毒。

[1] Opriessnig T, McKeown N E, Zhou E M, et al. Genetic and experimental comparison of porcine circovirus type 2 （PCV-2） isolates from cases with and without PCV-2-associated lesions provides evidence for differences in virulence[J]. J Gen Virol , 2006, 87: 2923-2932.

[2] Delay J, McEwen B, Carman S, et al. Porcine circovirus type 2-associated disease is increasing[J]. AHL Newsletter, 2005（9）: 22.

[3] Dupont K, Nielsen E O, Baekbo P, et al. Genomic analysis of PCV-2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time[J]. Veterinary Microbiology , 2008, 128: 56-64.

[4] Grau-Roma L, Crisci E, Sibila M, et al. A proposal on porcine circovirus type 2 （PCV2） genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome （PMWS） occurrence[J]. Vet Microbiol, 2008, 128: 23-35.

[5] Opriessnig T, Ramamoorthy S, Madson DM, et al. Differences in virulence among porcine circovirus type 2 isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection[J]. Journal of General Virology , 2008, 89: 2482-2491.

[6] Lefebvre D J, Costers S, Van Doorsselaere J, et al. Antigenic differences among porcine circovirus type 2 strains, as demonstrated by the use of monoclonal antibodies [J]. Journal of General Virology, 2008, 89: 177-187.

[7] 王芳, 蓋新娜, 郭鑫. 豬圓環(huán)病毒2型BF株感染性分子克隆系列突變株的構(gòu)建[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2007, 43（12 ）: 17-19.

[8] 侯強紅, 余興龍, 李薇. 豬圓環(huán)病毒2群Cap蛋白部分基因序列與大腸桿菌LTB成熟肽基因的融合表達(dá)及免疫原性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2007, 29（11）: 847-851.

[9] Carman S, Cai H Y, Delay J, et al. The emergence of a new strain of porcine circovirus-2 in Ontario and Quebec swine and its association with severe porcine circovirus associated disease-2004-2006[J]. Canadian Journal of Veterinary Research , 2008, 72: 259-268.

[10] Olvera A, Cortey M. Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes: Phylogeny and clonality[J]. Virology , 2007, 357: 175-185.

[11] Cheung A K, Bolin S R. Kinetics of porcine circovirus type 2 replication[J]. Arch Virol, 2002, 147: 43-58.

[12] Meerts P, Misinzo G, McNeilly F, et al. Replication kinetics of different porcine circovirus 2 strains in PK-15 cells, fetal cardiomyocytes and macrophages[J]. Arch Virol, 2005, 150: 427-441.

[13] Fenaux M, Halbur P G, Haqshenas G, et al. Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: Characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions[J]. Journal of Virology, 2002 （6）: 541-551.

英文編輯：羅文翠