邱美珍，周望平，肖兵南，杜麗飛，胡述光，劉毅，陳江

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

目前，牛結(jié)核病的早期臨床診斷仍以皮內(nèi)變態(tài) 反應（TST）為主，但其檢測的敏感性和特異性不高。隨著免疫機理研究的深入，建立了牛 γ-干擾素ELISA診斷法（IFN-γ-ELISA），在國外已通過臨床試驗，證實了用該法診斷牛結(jié)核病的可靠性[1]。大量研究[2-8]表明，特異性診斷抗原影響IFN-γ-ELISA診斷的靈敏度。Amadori等[2]運用分子生物學手段，制備了特異性診斷抗原，使得IFN-γ-ELISA診斷的特異性有所提升。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，特異性抗原CFP10/ESAT6誘導的IFN-γ釋放反應的靈敏度略低于PPD誘導的IFN-γ釋放反應。筆者通過親和層析純化牛結(jié)核菌純蛋白衍生物（PPD）抗原，并制備兔抗草分支桿菌抗體，將其偶聯(lián)到CNBr活化的凝膠上，探討牛結(jié)核病的IFN-γ-ELISA診斷?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

（1） 樣品。無菌采集長沙某養(yǎng)殖場60份奶牛血。

（2） 菌種與試劑。草分支桿菌購自中國科學院微生物研究所（菌種編號為 4.1180）；牛 γ-干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒購自ADL公司；溴化氰活化的凝膠（CNBr-Sepharose 4B）購自法馬西亞公司；牛PPD和禽PPD均購自黑龍江省生物制品一廠。

1.2 方 法

1.2.1 診斷抗原、抗體的制備

1） 草分支桿菌菌體抗原的制備。將草分支桿菌培養(yǎng)后，離心，收集菌泥。將菌泥充分研磨，稀釋，靜置過夜，將上層液體配成OD525nm為0.4的混懸液。

2） 兔抗草分支桿菌抗體的制備。選取 2只2.0～2.5 kg的健康公兔，在其皮下多點多次注射草分支桿菌進行免疫。每次免疫后于耳靜脈采血，收集血清，待試管凝集價達1∶800以上時將兔處死，采血并分離血清。血清用飽和硫酸銨提純。用Bradford法[9]測定血清抗體蛋白含量。

3） 親和抗原的制備[10-11]。取純化的兔抗草分支桿菌抗體約18 mg與1 g膠（CNBr-Sepharose 4B）混勻，室溫作用 2 h。離心后裝柱，過量的配基用偶聯(lián)緩沖液洗滌。收集全部未偶聯(lián)的蛋白，Bradford法[9]測定蛋白含量。加入封閉液，室溫下?lián)u勻2 h，棄上清，分別用pH4.0和pH8.0的緩沖液洗膠，洗3個循環(huán)。再用磷酸緩沖液（PBS）洗2次。測定最后1次洗滌液的OD280nm，使OD280nm＜0.02，保存于4℃?zhèn)溆?。加入PPD，上樣量3 mg。室溫感作30 min。以PBS沖洗，收集洗脫液，洗脫至OD280nm＜0.02。將所有蛋白洗脫管合并，所得即為PPD親和層析抗原。加pH2.4的Gly-HCl緩沖液，收集解吸下來的成分，立即以NaHCO3中和。用Bradford法[9]測定蛋白含量。

1.2.2 牛結(jié)核病的檢測方法

1） 皮內(nèi)變態(tài)反應（TST）檢測。按常規(guī)方法[10]對60頭奶牛進行檢測。參照文獻[12]，僅用牛型 PPD在牛頸部進行變態(tài)反應試驗。劑量為2 000 IU。注射前測量皮膚厚度，注射后 72 h再次測定皮膚厚度，皮厚差大于3 mm時判為牛結(jié)核病陽性，反之為牛結(jié)核病陰性。

2） 抗酸染色檢測。按照常規(guī)方法[10]對60份奶牛血清進行檢測。

3） 牛結(jié)核ELISA（PPD-ELISA）法檢測。首先，參照1.2.1（1）制備草分支桿菌吸收抗原，簡稱草吸抗原。其次，用草吸抗原處理血清：對 60份奶牛血檢測，取血清100 μL，分別加入草吸抗原100 μL，PBS 800 μL，37 ℃感作1 h；再取上清液100 μL，加入700 μL PBST，混勻后取100 μL加入到檢測孔。其他步驟按試劑盒操作程序進行。

4） IFN-γ-ELISA 法檢測[13]。對60份奶牛血進行檢測，無菌采血，肝素抗凝。采血后8 h內(nèi)檢測。檢測步驟按照試劑盒操作程序進行。

5） 用親和層析抗原IFN-γ-ELISA 法檢測。對TST法檢測有疑問的奶牛血重新進行檢測，無菌采血，肝素抗凝。采血后8 h內(nèi)檢測。將每份檢測血分為3份，分別加入禽PPD、未純化牛PPD、親和層析純化的牛PPD，然后在CO2（5%）培養(yǎng)箱37 ℃孵育18 h，離心獲得的血漿用于試驗。以PBS為對照。其他步驟按照試劑盒操作程序進行。

1.2.3 結(jié)果判定

牛γ-干擾素陰性對照OD值＜0.130，牛γ-干擾素陽性對照OD值＞0.700方可用。陰性對照重復孔差值不能大于0.040[14]。

敏感性＝真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)＋假陰性數(shù)）。

特異性＝真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)＋假陽性數(shù)）。

符合率＝（真陽性數(shù)＋真陰性數(shù)）/被檢總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗草分支桿菌抗體的偶聯(lián)率與親和層析結(jié)果

加入待偶聯(lián)的蛋白共18 mg，收集到未偶聯(lián)的蛋白共約3 mg，偶聯(lián)率為83.3%。親和層析結(jié)果表明，第1次洗脫下來的成分主要是特異性的牛結(jié)核PPD抗原；第2次解吸附下來的成分主要是被兔抗草分支桿菌抗體吸附的抗原，是非特異性的成分，用Bradford法測得第1次洗脫和第2次解吸附的蛋白總量分別為2.6、0.4 mg。

2.2 4種方法對牛結(jié)核病的檢測結(jié)果

4種方法對60頭牛結(jié)核病的檢測結(jié)果為：TST檢測出陽性3例，陰性44例，疑似15例；抗酸染色法檢出陽性6例，陰性54例；PPD-ELISA法檢出陽性7例，陰性51例，疑似2例；IFN-γ-ELISA法檢出陽性6例，陰性54例?？梢姡栃詸z出率最高是PPD-ELISA法，為11.6%，最低的是TST法，為5%；疑似檢出率最高的是TST法，為21.6%，其次是 PPD-ELISA法；抗酸染色和 IFN-γ-ELISA法沒有疑似病例。

2.3 4種方法的檢測敏感性、特異性和符合率

表1結(jié)果表明，與抗酸染色相比，IFN-γ-ELISA法的敏感性、特異性和符合率都比較高；TST法的敏感性和特異性為 100%，但符合率比較低，主要是因為疑似病例較多；PPD-ELISA的敏感性較低，也存在疑似病例。

表1 4種檢測方法的敏感性、特異性和符合率Table 1 Sensitivity, specificity, consistency of detection results by four tests %

2.4 3種抗原刺激的ⅠFN-?-ELⅠSA檢測結(jié)果

世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦使用牛 PPD、禽PPD比較IFN-γ釋放反應，以排除環(huán)境分支桿菌對牛結(jié)核診斷的干擾.本試驗中使用牛/禽結(jié)核菌素比較反應（包括皮內(nèi)變態(tài)反應和 IFN-γ釋放反應），發(fā)現(xiàn)1例抗酸染色陽性的牛（表2），親和層析抗原純化PPD（牛PPD’）的IFN-γ-ELISA檢測OD值為0.166，判為陰性；未經(jīng)親和層析處理PPD的IFN-γ-ELISA檢測OD值為0.385，判為陽性，這證明PPD中的非特異成分，經(jīng)親和層析后被吸附，從而排除了環(huán)境分支桿菌對試驗的干擾。雖然本試驗中可以用禽PPD刺激IFN-γ釋放反應作為對照來排除環(huán)境分支桿菌對試驗的影響，但是，如果發(fā)生牛和禽結(jié)核或其他環(huán)境分支桿菌的同時感染時，親和層析抗原刺激的IFN-γ釋放反應就具有很大的優(yōu)勢。

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，與抗酸染色相比，IFN-γ-ELISA的特異性、符合率較高，達 90%以上，敏感性也達到了83.33%。該方法有望替代TST法[15-19]在中國推廣使用。

結(jié)核分支桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，在機體發(fā)生免疫的過程中，初期是誘發(fā)細胞免疫，并釋放出各種細胞因子。IFN-γ是結(jié)核菌感染時誘導的主要細胞因子[11-12]，因而，檢測結(jié)核菌特異抗原誘導的 IFN-γ釋放反應具有較高的靈敏度與特異性[20]。牛結(jié)核 γ-干擾素診斷依據(jù)是T淋巴細胞釋放的γ-干擾素水平，因此，能在結(jié)核病早期作出診斷。本試驗結(jié)果表明，與IFN-γ-ELISA、PPD-ELISA和抗酸染色法相比，TST法有著本身固有的缺陷：操作和結(jié)果判斷主觀，非特異性反應現(xiàn)象常見，疑似病例較多。PPD-ELISA的敏感性較低，也存在疑似病例?？顾崛旧o法區(qū)分死菌和活菌，結(jié)果受試驗條件和檢驗人員鏡檢技術(shù)水平的影響較大，靈敏度低（通常需要5 000～10 000個/mL抗酸桿菌才能得到陽性結(jié)果），特異性差（各種抗酸桿菌均可著色，需通過進一步試驗才能確定是否為結(jié)核菌）[16-18]，而IFN-γ-ELISA法的敏感性、特異性和符合率都比較高。

牛感染結(jié)核桿菌與環(huán)境分支桿菌可以分為以下3種情況：只感染牛結(jié)核菌，只感染環(huán)境分支桿菌，同時感染牛結(jié)核菌與環(huán)境分支桿菌。在前2種情況下，牛/禽結(jié)核菌素比較反應值與牛結(jié)核菌感染呈正相關(guān)，即比較反應結(jié)果為正值時表示牛結(jié)核菌感染，比較結(jié)果為負值時為環(huán)境分支桿菌感染；后一種情況，IFN-γ比較釋放反應值與牛結(jié)核菌感染實際情況嚴重不符?；旌细腥緯r，牛/禽PPD的IFN-γ比較釋放反應靈敏度低，準確度差，陰性牛被判為假陽性。相比之下，親和層析抗原被吸附掉草分支桿菌及類屬抗原成分，所誘導的IFN-γ釋放反應很大程度降低了環(huán)境分支桿菌感染的影響，親和抗原誘導的IFN-γ釋放水平不比牛PPD低，所以，該反應具有很高的靈敏度與特異性。

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英文編輯：羅文翠